1、 CL-316243 对 3T3-L1 脂肪细胞中 UCP1 表达的影响及相关通路的探讨孙高洁,王姣,崔岩,王守俊(通讯作者）（郑州大学第一附属医院内分泌科，河南郑州 450052）【摘要】目的 探讨 3 肾上腺素能受体激动剂 CL-316243 对 3T3-L1 脂肪细胞中解耦连蛋白 1（UCP1）表达的影响及其与 PKA 和 p38/MAPK 信号通路的关系。方法 将 3T3-L1 前脂肪细胞诱导成为脂肪细胞，10 -7molL 和 10-5molL 的CL-316243 作用 3T3-L1 脂肪细胞 48h 后，RT-PCR 法检测解耦连蛋白 1（UCP1）mRNA 的转录水平，West
2、ern blotting 法检测 UCP1 蛋白的表达水平，ELISA 法检测蛋白激酶 A(PKA)的浓度。10 -5molL CL-316243 及联合 p38MAPK 抑制剂作用 3T3-L1 脂肪细胞 48h，Western blotting 法检测 p38 磷酸化程度。结果 10 -7molL 和 10-5molL CL-316243 处理组中 UCP1 和 PKA 的表达水平较对照组均升高，差异有统计学意义（ P0.05)；10 -5molL CL-316243 及联合p38MAPK 抑制剂作用 3T3-L1 脂肪细胞 48h 后，p38 磷酸化程度较对照组升高，差异有统计学意义（
3、P0.05)。结论 3 肾上腺素能受体激动剂 CL-316243 可促进 3T3-L1 脂肪细胞中 UCP1 的表达，其可能与 PKA 和 p38/MAPK 信号通路的激活有关。【关键词】3 肾上腺素能受体激动剂；CL-316243;3T3-L1 脂肪细胞;解耦连蛋白 1;蛋白激酶 A；p38/MAPK 通路Effect of CL-316243 on expression of UCP1 in 3T3-L1 adipocytes and exploration of the related pathwaysSun Gaojie，Wang Jiao，Cui Yan，Wang Shoujun (
4、Department of Endocrinology, First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052,China)【Abstract】Objective To investigate the effect of 3-adrenoceptor agonist CL-316243 on expression of UCP1 in 3T3-L1 adipocytes and to explore the related mechanism with PKA and p38/MAPK pathways. Met
5、hods Induce the 3T3-L1 preadipocytes into adipocytes,then the 3T3-L1 adipocytes were treated with increasing concentration of CL-316243 or CL-316243 combained with specific p38MAPK inhibitor for 48 hours .The transcription level of UCP1 mRNA was evaluated by RT-PCR,the protein expression level of UC
6、P1 and the phosphorylation extent of p38 were evaluated by Western blotting，the concentration of protein kinase A（PKA）was evaluated by Elisa. Results 1.The expression levels of UCP1 and PKA after treatment with 10-7mol/L and 10-5mol/L CL-316243 were both higher than those in the corresponding contro
7、l group（ P0.05)；2.The phosphorylation extent of p38 after treatment with 10-5mol/L CL-316243 combained with specific p38MAPK inhibitor was higher than it in the corresponding control group（ P0.05).Conclusion 3-adrenoceptor agonist CL-316243 can promote the expression level of UCP1 in 3T3-L1 adipocyt
8、es，the role may be activation of PKA and p38/MAPK signaling pathways.【Key words】3-adrenoceptor agonist;CL-316243; 3T3-L1 adipocytes; uncoupling protein1（UCP1);protein kinase A（PKA） ；p38/MAPK随着生活方式的改变和生活水平的提高，肥胖症和2型糖尿病的发病率逐年升高，威胁人类的健康 1。人体内有两种脂肪组织，即白色脂肪组织（ WAT）和棕色脂肪组织(BAT)，WAT与BAT在能量代谢中发挥着截然相反的作用,WAT
9、主要是通过甘油三酯贮存能量, 而BAT则是通过它细胞内大量的线粒体及表达解偶联蛋白1（UCP1）产热来消耗能量 9。研究表明，高水平的棕色脂肪组织参与阻止代谢性疾病的发生，有助于减轻体重和维持机体血糖稳态 4,5,因此促使白色脂肪组织向棕色脂肪组织转化可能为治疗肥胖症提供一个比较有效的方法。目前研究发现,3肾上腺素能受体激动剂可刺激白色脂肪组织的脂解，也可诱导白色脂肪组织中出现棕色脂肪细胞 2,6。本研究探讨不同浓度的选择性 3肾上腺素能受体激动剂CL-316243对3T3-L1脂肪细胞解耦连蛋白1（UCP1）表达水平的影响，并揭示其可能存在的细胞信号转导通路，进而探讨CL-316243对白色
10、脂肪组织棕色化的影响及作用机制，为肥胖症、糖尿病等相关代谢性疾病的诊治提供新的研究思路。1.材料与方法1.1 主要实验用品及化学试剂 3T3-L1 前脂肪细胞株购自武汉博士德公司。地塞米松（Dexamethasone，Dex） 、胰岛素（Insulin） 、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（1-Methyl-3-isobuthylxanthine，IBMX)和 3 肾上腺素受体激动剂 CL-316243 均购自 Santa 公司；Trizol 试剂购自 TakaRa 公司；逆转录试剂盒和PCR Master Mix 均购自北京全式金公司；UCP1 抗体购自 Abgent 公司;PKA Elisa 试
11、剂盒购自 RD 公司；p38MAPK 抑制剂 SB203580、p38 抗体、磷酸化 p38抗体及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG 均购自上海碧云天生物技术公司。1.2 脂肪细胞的培养、诱导分化及药物干预将 3T3-L1 前脂肪细胞接种于含 10%FBS 的 DMEM 高糖培养基中，于370C，5%CO2 条件下培养，待细胞生长至完全融合后换用含 10%FBS、1umol/L Dex、0.5umol/L Insulin、0.5mmol/L IBMX 的 DMEM 高糖培养基诱导分化，3d后换用含 10%FBS、1umol/L Dex、0.5umol/L Insulin 的 DMEM 高糖培养
12、基继续培养，每 2d 更换 1 次，至第 10 天，约 90% 3T3-L1 细胞呈脂肪细胞表型。脂肪细胞分化成熟后，不同浓度组的 CL-316243 作用脂肪细胞 48h 后，提取细胞总RNA,进行 RT-PCR 检测；提取细胞总蛋白，进行 Elisa 和 Western blotting 检测。1.3 3T3-L1 脂肪细胞中 UCP1 基因 mRNA 转录水平的检测采用 RT-PCR 法。根据 GenBank 中登录的 UCP1（NM_009463.3）和内参 -actin（NM_007393）基因序列设计引物，各基因的引物序列、循环数及 Tm 值见表 1。UCP1 基因引物由宝生物公司
13、合成。用 Trizol 试剂提取各组细胞总 RNA,逆转录合成 cDNA,以其为模板进行 PCR 扩增，反应条件为：94 0C 预变性5min，94 0C 变性 30s，退火 30s，72 0C 延伸 20s，循环结束后 720C 再延伸10min。PCR 扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，用凝胶成像系统对电泳谱带进行半定量分析。1.4 3T3-L1 脂肪细胞中 UCP1 蛋白及 p38 磷酸化蛋白表达水平的检测Western blotting 检测 UCP1 蛋白及 p38 磷酸化蛋白的表达 脂肪细胞以8104 个/孔接种于 6 孔板，贴壁 24h,不同浓度的 CL-316243 作用
14、细胞 48h，同时设立对照组。提取细胞总蛋白；BCA 法测定蛋白浓度；SDS-PAGE 胶上每泳道上样 37.5ug 蛋白，进行电泳，转膜，封闭，一抗 UCP1（1:200） 、p38（1:1000） 、磷酸化 p38(1:1000)、-actin（1:1000）摇床 40C 孵育过夜，TBST 洗膜 5min3 次，加 HRP 标记的二抗（1：1000）孵育 1h，洗涤 3 次后DAB 显色。1.5 3T3-L1 脂肪细胞中蛋白激酶(PKA)浓度的检测Elisa 法检测 PKA 的浓度 在微孔酶标板上设置标准品孔和样本孔，各加不同浓度的标准品和样本 50uL,再在每孔中加入 HRP 标记的检
15、测抗体100uL,370C 水浴锅温育 60min，手工洗板，然后每孔加入底物 A、B 各50uL,370C 避光孵育 15min，每孔加入终止液 50uL，15min 内，在酶标仪 450nm波长处测定各孔的 OD 值，计算样品浓度。1.6 统计学分析应用 SPSS17.0 统计学软件进行统计学分析，计量资料均数标准差（xs）表示，两组数据比较采用两独立样本 t 检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD-t 检验,以 P0.05 为差异有统计学意义。2. 结果2.1 PCR 法测定不同浓度的 CL-316243 作用 3T3-L1 脂肪细胞 48h 后 UCP1 mRNA
16、的转录情况 10 -7molL 和 10-5molL CL-316243 作用 3T3-L1 脂肪细胞 48h 后，均表现为较对照组 UCP1 mRNA 转录水平升高，差异有统计学意义 (P0.05)。见图 1 及表 2。2.2 Western blotting 法测定不同浓度的 CL-316243 作用 3T3-L1 脂肪细胞 48h后 UCP1 蛋白的表达情况 10-7molL 和 10-5molL CL-316243 作用 3T3-L1 脂肪细胞 48h 后，表现为较对照组 UCP1 蛋白表达水平均升高，差异有统计学意义(P0.05)。见图 2 及表 3。2.3 ELISA 法测定不同浓
17、度的 CL-316243 作用 3T3-L1 脂肪细胞 48h 后 PKA 的浓度 10-7molL 和 10-5molL CL-316243 作用 3T3-L1 脂肪细胞 48h 后，表现为较对照组 PKA 的浓度均升高，差异有统计学意义( P0.05)。见表 4。2.4 Western blotting 法测定 10-5molL CL-316243 及联合 p38MAPK 抑制剂SB203580 处理 3T3-L1 脂肪细胞后 p38 的磷酸化程度 10-5molL CL-316243及联合 SB203580 作用 3T3-L1 脂肪细胞 48h 后，表现为较对照组 p38 磷酸化程度升高
18、，差异有统计学意义( P0.05)。见图 3 及表 5。3.讨论线粒体内膜的解偶联蛋白1(UCP1)是一种在棕色脂肪组织（BAT)特异表达的线粒体内膜蛋白质,是决定棕色脂肪组织功能的关键因素 7,8，因此可成为衡量白色脂肪细胞向棕色脂肪细胞转化的一个特异性指标。3 肾上腺素能受体(3-adrenergic receptors,3-AR) 主要调节机体的脂肪分解和产热过程，同时它被激活后，可上调UCP1的表达,从而诱导白色脂肪组织棕色化 2。已有文献指出，去甲肾上腺素刺激3-AR后可激活PKA旁路，引起UCP1快速调节物(如FFA)的释放，也可激活p38/MAPK旁路，从而上调UCP1 11。本
19、研究以小鼠3T3-L1脂肪细胞为靶细胞，排除干扰因素，采用RT-PCR法测定10 -7molL和10 -5molL的CL-316243对3T3-L1脂肪细胞中的UCP1 mRNA转录水平的影响,结果显示UCP1 mRNA的转录水平较对照组均升高，两处理组间差异有统计学意义。为进一步验证结果的准确性，本研究采用western blotting技术测定10 -7molL和10 -5molL的CL-316243在作用于3T3-L1脂肪细胞48h后UCP1蛋白的表达情况，结果显示较对照组均表现为UCP1蛋白的表达升高，两处理组间差异有统计学意义。说明CL-316243作用于3T3-L1脂肪细胞后可促进
20、UCP1的表达。本研究同时探讨此过程与PKA及p38/MAPK信号通路的调节有关，采用ELISA法测定10 -7molL和10 -5molL的CL-316243在作用于3T3-L1脂肪细胞48h后PKA的浓度，结果显示较对照组均表现为PKA浓度升高，两处理组间差异有统计学意义。采用western blotting法测定10 -5molL CL-316243及联合p38MAPK抑制剂SB203580作用3T3-L1脂肪细胞48h后，结果显示较对照组表现为p38的磷酸化程度升高，差异有统计学意义。说明CL-316243促进小鼠3T3-L1脂肪细胞中UCP1表达过程中，PKA及p38/MAPK信号通
21、路均起一定作用。综上所述，本研究结果表明选择性 3 肾上腺素能受体激动剂 CL-316243可促进小鼠 3T3-L1 脂肪细胞中 UCP1 的表达，并可能与 PKA 及 p38/MAPK 细胞信号转导途径的激活有关系。因此，3 肾上腺素能受体旁路的激动在抵抗肥胖和糖尿病的过程中发挥一定的作用，在下一步的实验中，我们将继续探讨其作用机制，进行相关指标的测定及其它细胞信号转导途径等研究。参考文献1史轶蘩，21 世纪的人类杀手-肥胖症J。中华内科杂志，2000，39（4）：221。 2刘昭前, 孙红, 刘亚利, 等. 特异性 3 肾上腺素能受体激动剂研究进展 J. 中国药理学通报, 2005, 21
22、(10): 1153-1157.3Wang Q, Zhang M, Ning G, et al. Brown adipose tissue in humans is activated by elevated plasma catecholamines levels and is inversely related to central obesityJ. PLoS One, 2011, 6(6): e21006.4孙慧,杨娜娜,黄雪芳等. 棕色脂肪组织特异性基因在抵抗肥胖中作用的研究J. 临床消化病杂志,2013,01:3-9.5Asensio C,Jimenez M,Khne F,Rohn
23、er-J，et al.The lack of -adrenoceptors results in enhanced insulin sensitivity in mice exhibiting increased adiposity and glucose intoleranceJ. Diabetes, 2005 ,54(12):3490-5.6Festuccia W T, Blanchard P G, Richard D, et al. Basal adrenergic tone is required for maximal stimulation of rat brown adipose
24、 tissue UCP1 expression by chronic PPAR- activationJ. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology, 2010, 299(1): R159-R167.7孙长颢,刘荣,闻颖等. 解偶联蛋白在肥胖抵抗中的作用J. 中国公共卫生,2004,02:47-49.8肖放,孙野青. 解偶联蛋白及功能研究进展J. 生命的化学,2003,01:14-17.9D. Tews M. Wabitsch，etal.Renaissance of Bro
25、wn Adipose TissueJ.Horm Res Paediatr 2011;75:23123910Liu Y, Zhang Y, Xu Q, et al. Increased Norepinephrine by Medium-Chain Triglyceride Attributable to Lipolysis in White and Brown Adipose Tissue of C 57 BL/6 J MiceJ. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 2012, 76(6): 1213-1218.11Brondani L A
26、, Assmann T S, Duarte G C K, et al. The role of the uncoupling protein 1 (UCP1) on the development of obesity and type 2 diabetes mellitusJ. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia, 2012, 56(4): 215-225.表 1 各基因的引物序列、循环数及退火温度Tab 1.Sequences of primers，numbers of cycles and temperatures f
27、or annealing of various genes基因 序列（53） 循环数 Tm 值（ 0C）UCP1 Forard： CACTCAGGATTGGCCTCTACGAC 35 55.7Reverse：GCTCTGGGCTTGCATTCTGAC-actin Forard： GTCCCTCACCTCCCAAAA 35 64.5Reverse：GCTGCCTCAACACCTCAACCCa b ca.对照组 ；b.低浓度组（10 -7molL）；c.高浓度组（10 -5molL）图 1 RT-PCR 检测不同浓度 CL-316243 处理的 3T3-L1 脂肪细胞中 UCP1 基因mRNA 的
28、转录水平Fig 1.Determination transcription levels of UCP1 mRNAs in 3T3-L1 adipocytes after treatment with CL-316243 at various concentrations by RT-PCR表 2 不同浓度 CL-316243 处理的 3T3-L1 脂肪细胞中 UCP1 基因 mRNA 的相对转录水平（x s）Tab2.Relative transcription levels of UCP1 mRNAs in 3T3-L1 adipocytes after treatment with CL
29、-316243 at various concentrations （x s）组别 例数 UCP1对照组 3 0.430.01低浓度组(10 -7molL) 3 0.580.01*高浓度组(10 -5molL) 3 0.680.02*F 值 188.91P 值 0.000注： LSD-t 检验，与对照组比较，* P0.05a b c-actinUCP1a.对照组 ；b.低浓度组（10 -7molL）；c.高浓度组（10 -5molL）图 2 Western blotting 检测不同浓度 CL-316243 处理的 3T3-L1 脂肪细胞中 UCP1 蛋白表达的水平 Fig2 .Express
30、ion levels of UCP1 in 3T3-L1 adipocytes after treatment with CL-316243 at various concentrations by Western blotting表 3 不同浓度 CL-316243 处理的 3T3-L1 脂肪细胞中 UCP1 蛋白的相对表达水平（x s，%）Tab 3.Relative expression levels of UCP1 in 3T3-L1 adipocytes after treatment with CL-316243 at various concentrations （x s，%）组
31、别 例数 UCP1对照组 3 31.892.71低浓度组(10 -7molL) 3 37.421.81*高浓度组(10 -5molL) 3 44.072.58*F 值 19.40P 值 0.002注： LSD-t 检验，与对照组比较，* P0.05表 4 不同浓度 CL-316243 处理的 3T3-L1 脂肪细胞中 PKA 的浓度（x s）Tab 4.Concentration of PKA in 3T3-L1 adipocytes after treatment with CL-316243 at various concentrations （x s）组别 例数 PKA(U/L)对照组
32、3 336.45 5.52低浓度组(10 -7molL) 3 369.55 14.60*高浓度组(10 -5molL) 3 412.76 6.94*F 值 45.20P 值 0.000注： LSD-t 检验，与对照组比较，* P0.05a b-actinp38p-p38a.对照组 ；b.10 -5molL CL-316243 组图 3 10-5molL CL-316243 及联合 SB203580 作用 3T3-L1 脂肪细胞 48 后p38 的磷酸化程度Fig3.The phosphorylation extent of p38 after treatment with 10-5molL C
33、L-316243 combained with SB203580 for 48h表 5 10-5molL CL-316243 及联合 SB203580 作用 3T3-L1 脂肪细胞 48 后 p38的磷酸化程度（x s，%）Tab 5.The phosphorylation extent of p38 after treatment with 10-5molL CL-316243 combained with SB203580 for 48h（x s，%）组别 例数 p-p38/p38对照组 3 42.031.2810-5molL CL-316243 组 3 54.692.39t 值 -8.08P 值 0.001
