1、以上介绍的方法用于测定中性蛋白酶(pH7.2)。若要测定酸性蛋白酶或碱性蛋白酶, 则把配制酪蛋白溶液和稀释酶液用的 pH 缓冲液换成相应 pH 缓冲液即可。现把几种常用pH 缓冲液配方提供如下: 1.5.1 pH7.5 磷酸盐缓冲液 (0.02mol/L) 称取磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)6.02g 和磷酸二氢钠 (NaH2PO42H2O)0.5g 以蒸 馏水溶解定容至 1000mL。 1.5.2 pH 2.5 乳酸-乳酸钠缓冲液 (0.05mol) A 液: 称取 80%90%乳酸 10.6g,加蒸馏水稀释定容至 1000mL。 B 液: 称取 70%乳酸钠 16g,加水稀释定容至
2、 1000mL。 取 A 液 16mL 与 B 液 1mL 混合稀释一倍即成。 1.5.3 pH 3.0 乳酸-乳酸钠缓冲液 (0.05mol) A 液: 称取 80%90%乳酸 10.6g,以水定容至 1000mL。 B 液: 称取 70%乳酸钠 16g,蒸馏水溶解定容至 1000mL。 取 A 液 8mL 与 B 液 1mL,混合稀释一倍即成。 1.5.4 pH 10 硼砂-氢氧化钠缓冲液 A 液: 称取硼砂 19.08g,用蒸馏水溶解定容至 1000mL (0.05mol)。 B 液: 称取氢氧化钠 8g,用蒸馏水溶解定容至 1000mL (0.2N)。 取 A 液 250mL,B 液
3、215mL 混合,用蒸馏水稀释定容至 1000mL 即成。 1.5.5 pH 11.0 硼砂-氢氧化钠缓冲液 A 液: 称取硼砂 19.08g,用蒸馏水定容至 1000mL 。 B 液: 称取氢氧化钠 4g,用蒸馏水定容至 1000mL 。 取 A 液与 B 液等量混合。 1.5.6 2%酪蛋白溶液配成酸性时 ,须先加数滴浓乳酸,使之湿润以加速其溶解。请问 50mmol/L 的乳酸钠缓冲液（ PH4.5）和 125mmol/L 的酒石酸钠缓冲液(PH3.0)如何配制？从瓶子上查 1mol/L 的试剂要加多少水，按比例加，然后分别稀释 20 倍，8 倍就行了。 调 PH 比较麻烦， 配 50mm
4、ol/L 的乳酸钠 用乳酸调到 PH4.5 125mmol/L 的酒石酸钠缓冲液 (PH3.0) 用酒石酸/氢氧化钠调到 3.0 调 PH 的原则是不引入其他离子。有这个公式的 无机化学上有 缓冲溶液 buffer solution 缓冲液是一种能在加入少量酸或碱时抵抗 pH 改变的溶液。PH 缓冲系统对维持生物的正常 pH 值，正常生理环境起重要作用。多数细胞仅能在很窄的 pH 范围内进行活动，而且需要有缓冲体系来抵抗在代谢过程中出现的 pH 变化。在生物体中有三种主要的 pH 缓冲体系，它们时蛋白质、重碳酸盐缓冲体系。每种缓冲体系所占的分量在各类细胞和器官中是不同的。 在生化研究工作中，常
5、常要用到缓冲溶液来维持实验体系的酸碱度。研究工作的溶液体系 pH 值的变化往往直接影响到我们工作的成效。如果提取酶实验体系的 pH 值变化或变化过大，会使酶活性下降甚至完全失活。所以我们要学会配制缓冲溶液。 由弱酸及其盐组合一起使具有缓冲作用。生化实验室常常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tiris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，在生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的 pH 值，而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的反应。 硼酸盐：硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。 柠檬酸盐：柠
6、檬酸盐离子容易与钙结合，所以存在有钙离子的情况下不能使用。 磷酸盐：在有些实验，它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物，重金属易以磷酸盐的形式从溶液中沉淀出来。而且它在 pH7.5 以上时缓冲能力很小。 三羟甲基氨基甲烷：它可以和重金属一起作用，但在有些系统中也起抑止的作用。其主要缺点时温度效应。这点往往被忽视，在室温 pH 是 7.8 的 Tris 一缓冲液，在 4时是 8.4，在 37时是 7.4，因此，4配制的缓冲液拿到 37测量时，其氢离子浓度就增加了 10 倍。而且它在 pH7.5 以下，缓冲能力很差。 缓冲液的 pH 值由哪些因素决定？ 设缓冲系统的弱酸的电离常数为 K（平衡常数） ，平
7、衡时弱酸的浓度为酸，弱酸盐的浓度为盐，则由弱酸的电离平衡式可得下式： 根据此式可得出下列几点结论： （1）缓冲液的 pH 值与该酸的电离平衡常数 K 及盐和酸的浓度有关。弱酸一定，但酸和盐的比例不同时，可以得到不同的 pH 值。当酸和盐浓度相等时，溶液的 pH 值与 PK 值相同。 （2）酸和盐浓度等比例也增减时，溶液的 pH 值不便。 （3）酸和盐浓度相等时，缓冲液的缓冲效率为最高，比例相差越大，缓冲效率越低，一般地说缓冲液有效缓冲范围为 PK1pH。 从上述可知，只要知道缓冲对的 PK 值，和要配制的缓冲液的 pH 值（及要求的缓冲液总浓度）时，可按公式计算出盐和酸的量。这样算涉及到对数的
8、换算，较麻烦，前人为减少后人的计算麻烦，经计算已为我们总结出 pH 值与缓冲液对离子用量的关系列出了表格。讲义附录部分节录有磷酸缓冲液的配制表。只要我们知道要配制的缓冲液的 pH，经查表便可计算处所用缓冲剂的比例和用量。例如配制 500nmpH5.8浓度为 0.1M 磷酸缓冲液。 经查表知 pH5.8 浓度为 0.2M Na2HPO48.0 毫升，而 0.2M Na2HPO492.0 毫升。依此可推论出配制100ml0.1M 的磷酸缓冲液需要 0.1M Na2HPO48.0 毫升，而 0.1M Na2HPO4 需要 92.0 毫升。 计算好后，按计算结果称好药品，放于烧杯中，加少量蒸馏水溶解，转移入 50ml 容量瓶，加蒸馏水至刻度，摇匀，便得所需的缓冲液。 各种缓冲溶液的配制，均按下表按比例混合，某些试剂，必须标定配成准确的浓度才能进行，如醋酸、NaOH 等。
