1、1附件 1：增强免疫力功能评价方法（征求意见稿）保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定Items, Principles and Result Assessment1 试验项目1.1 动物实验1.1.1 体重1.1.2 脏器/体重比值测定：胸腺/体重比值，脾脏/体重比值1.1.3 细胞免疫功能测定：小鼠脾淋巴细胞转化实验，迟发型变态反应实验1.1.4 体液免疫功能测定：抗体生成细胞检测，血清溶血素测定1.1.5 单核巨噬细胞功能测定：小鼠碳廓清实验，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验1.1.6 NK 细胞活性测定2 试验原则2.1 所列的指标均为必做项目2.2 分为正常动物实验方案和免疫功能低
2、下模型动物实验两种方案, 可任选其一进行实验.2.3 采用免疫功能低下动物模型实验方案时需做外周血白细胞总数测定3 结果判定3.1 采用正常动物实验，受试样品具有增强免疫力作用。在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能及 NK 细胞活性四个方面测定中，任两个方面试验结果为阳性，可以判定该受试样品具有增强免疫力作用。其中细胞免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定细胞免疫功能试验结果阳性。体液免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定体液免疫功能试验结果阳性。单核巨噬细胞功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定单核巨噬细胞功能试验结果阳性。NK 细胞活性测定实验的一个以上剂量结
3、果阳性，判定 NK 细胞活性结果阳性。正常动物实验需进行四个方面的测定。3.2 采用免疫功能低下动物实验，受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作用。在免疫功能低下模型成立条件下，血液白细胞总数、细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能及 NK 细胞活性五个方面测定中，任两个方面试验结果为阳性，判定该受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作用。其中细胞免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能试验结果阳性。体液免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能试验结果阳性。单核巨噬细胞功能测定项
4、目中两个实验的结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核巨噬细胞功能试验结果阳性。NK 细胞活性测定实验的一个以上剂量结果阳性，可以判定 NK2细胞活性结果阳性。血液白细胞总数测定的二个以上剂量结果阳性，可以判定血液白细胞总数结果阳性。免疫功能低下模型动物实验至少需进行三个方面的测定。同时在各项实验中，任何一项测试都不出现加重免疫抑制剂作用的结果。3增强免疫力功能检验方法Method for the Assessment of Enhancing Immune Function1. 原 理 ：免 疫 系 统 主 要 包 括 中央和外周淋 巴 器 官 、 淋 巴 组 织 和 全
5、身 各 处 的 淋 巴 细 胞 、抗 原 呈 递 细 胞 等 ， 还 包 括 血 液 中 的 白 细 胞 。 淋 巴 细 胞 经 血 液 和 淋 巴 使 各 处 的 淋巴 器 官 和 淋 巴 组 织 连 成 一 个 功 能 整 体 。 胸腺属中央淋巴器官，主要功能是确保T 淋巴细胞的产生和成熟。外周淋巴器官包括血液、淋巴管和免疫活性细胞；脾脏对抗原发生免疫应答作用，脾窦的巨噬细胞具有清除功能，脾白髓含有记忆 B细胞，产生对 T 依赖抗原的体液免疫应答。淋巴细胞是特异性免疫应答的主要细胞群，按其表面标志物，分为 T 细胞、B 细胞和天然杀伤细胞（NK）三大类，T细胞又分为 CD4+（Th）细胞和
6、 CD8+T 淋巴细胞。B 淋巴细胞转化为浆细胞后能合成和释放抗原特异抗体，所有抗体都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白分子都具有抗体功能。免疫系统可产生特异性免疫和非特异性免疫功能，检测上述免疫系统的各种代表性指标的改变可对增 强 免 疫 力 作 用 的 功 能 做 出 相 应 判 定 。2. 实验动物选择推荐用近交系小鼠，如 C57BL/6J、BALB/C 等，68 周龄，1822g（BALB/C 种可 16-18g） ，单一性别，雌雄均可，每组 1015 只。3. 剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和 1 个阴性对照组。以人体推荐量的 10 倍为其中一个剂量，另设二个剂量组。必
7、要时设阳性对照组。选做免疫低下模型法时，应设模型对照组。受试样品给予时间四周或 30 天。4免疫功能低下动物模型可选用环磷酰胺、氢化可的松或其他合适的免疫抑制剂进行药物造模。4.1 造模原理：4.1.1 环磷酰胺主要通过 DNA 烷基化破坏 DNA 的合成而非特异性地杀伤淋巴细4胞，并可抑制淋巴细胞转化；环磷酰胺对 B 细胞的抑制比 T 细胞强，一般对体液免疫有很强的抑制作用，对 NK 细胞的抑制作用较弱。4.1.2 氢化可的松主要通过与相应受体结合成复合物后进入细胞核，阻碍 NF-B 进入细胞核，抑制细胞因子与炎症介质的合成和释放，达到免疫抑制目的。氢化可的松还可损伤浆细胞，抑制巨噬细胞对抗
8、原的吞噬、处理、和呈递作用，所以氢化可的松对细胞免疫、体液免疫和巨噬细胞的吞噬、NK 作用都有一定的抑制作用。4.2 免疫抑制剂剂量选择环磷酰胺可选择 40mgkg，腹腔注射，连续两天，末次注射给药后第 5 天测定各项指标；氢化可的松可选择 40mgkg，肌内注射，隔天一次，共 5 次，末次注射给药后次日测定各项指标。各指标对两种模型敏感性不同，环磷酰胺模型比较适合抗体生成细胞检测、血清溶血素测定、白细胞总数测定；氢化可的松模型比较适合迟发型变态反应、碳廓清实验、腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验、NK 细胞活性测定，建议根据不同的免疫功能指标选择合适的模型。4.3 受试物给予连续给予受试物 4 周
9、或 30 天，在第 3 周后开始给予免疫抑制剂，进行模型与预防性给药相结合的实验。5. 实验方法5.1 血液白细胞数测定 小鼠外周血白细胞总数和淋巴细胞数检测方法(仪器法)全血用 EDTAK2抗凝后经血细胞分析仪检测，可测定白细胞数量，并可对白细胞进行分分类计数。5.1.1 仪器和材料乙二胺四乙酸二钾（EDTAK 22H2O，MW404.47） ，离心管，全血细胞分析仪上样管，眼科镊子，振荡器，加样枪，冷冻离心机，全血细胞分析仪。5.1.2 实验步骤5.1.2.1 试剂配制5血液抗凝：EDTAK 2能与血液中的钙离子结合成为螯合物，从而阻止血液凝固，1.52.2mg 的 EDTAK2可阻止 1
10、ml 血液凝固。抗凝剂配制：称量 8mg EDTAK2加纯净水至 100ml 制成抗凝剂，50l 抗凝剂可抗凝 1ml 小鼠全血。5.1.2.2 采血 以摘除小鼠眼球的方法采集全血，采用干净无菌的眼科镊子摘取小鼠一侧或双侧眼球，让血液自由滴入装有抗凝剂的 1.5ml 离心管（或商品化的抗凝管）中，采血过程中不断混匀血液与抗凝剂防止血液凝固，每只动物采集抗凝全血约 1ml。5.1.2.3 检测分析 上机前血液颠倒混匀，注意检查是否存在凝块。在 24h 内以全血细胞分析仪检测白细胞总数和淋巴细胞数。上机操作参照仪器说明书。5.1.3 数据分析一般采用方差分析，按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方
11、差齐，计算 F 值，p0.05，结论：各组均数间差异无显著性意义；F 值F 0.05，P0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐性要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。受试样品组的白细胞总数显著高于阴性对照组，可判定该项实验结果阳性。5.2 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验可任选下列方法之一5.2.1 MTT 法5.2.1.1 原理当 T 淋巴细胞受 ConA 刺激后发生母细胞增殖反应，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶将 MTT（一种淡黄色的唑
12、氮盐）分解为兰紫色结晶而显色，其光密度值能反映细胞的增殖情况。5.2.1.2 仪器和材料6RPMI1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇（2-ME） 、青霉素、链霉素、刀豆蛋白 A（ConA） 、盐酸、异丙醇、MTT、Hanks 液、PBS 缓冲液（pH7.2-7.4）纱布、200 目筛网、24 孔培养板，96 孔培养板（平底） ，手术器械、大号注射器内芯、二氧化碳培养箱、酶标仪、分光光度计、超净工作台、高压灭菌器、无菌滤器。5.2.1.3 实验步骤5.2.1.3.1 试剂配制完全培养液 RPMI1640 培养液过滤除菌，用前加入 10小牛血清， 1谷氨酰胺（200mmol/L） ，青霉
13、素（100U/mL） ，链霉素（100ug/L）及5105 mol/L 的 2-巯基乙醇，用无菌的 1mol/L 的 HCl 或 1mol/L 的 NaOH 调 pH至 7.0-7.2，即完全培养液。ConA 液 用双蒸水配制成 100ug/mL 的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（-20）保存。无菌 Hanks 液 用前以 3.5的无菌 NaHCO3调 pH7.2-7.4。MTT 液 将 5mgMTT 溶于 1mL pH7.2 的 PBS 中，现配现用。酸性异丙醇溶液 96mL 异丙醇中加入 4mL 1mol/L 的 HCl，临用前配制。5.2.1.3.2 脾细胞悬液制备无菌取脾，置于盛有适量（3
14、-5ml）无菌 Hanks 液平皿中，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经 200 目筛网过滤，用 Hanks 液洗 2 次，每次离心 10min（1000r/min） 。然后将细胞悬浮于 2mL 的完全培养液中，用全自动细胞计数仪计数脾细胞，或用台酚兰染色计数活细胞数（应在 95%以上） ，调整细胞浓度为 3106个/mL。5.2.1.3.3 淋巴细胞增殖反应将细胞悬液分两孔加入 24 孔培养板中，每孔 1mL，一孔加 75l ConA 液（相当于 7.5g/mL） ，另一孔作为对照，置 5CO 2，37CO 2孵箱中培养 72h。培养结束前 4h，每孔
15、轻轻吸去上清液 0.7mL，加入 0.7mL 不含小牛血清的RPMI1640 培养液，同时加入 MTT（5mg/mL）50l /孔，继续培养 4h。培养结束后，每孔加入 1mL 酸性异丙醇，超声震荡（2 秒）或人工吹打混匀，使紫色结7晶完全溶解。然后分装到 96 孔培养板中，每个孔分装 3 孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以 570nm 波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入 2mL 比色杯中，分光光度计上在波长 570nm 测定 OD 值。5.2.1.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值95）按 1106/mL YAC-
16、1细胞悬液加 3H-TdR 10uCi 进行标记，于 37、5CO 2培养箱中培养 2h，每30min 振荡 1 次。标记后的细胞用培养液洗涤 3 次，重悬于培养液中，使细胞浓度为 1105个/mL。5.8.2.3.2 脾细胞悬液的制备（效应细胞）无菌取脾，置于盛有适量无菌 Hanks 液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单细胞悬液。经 200 目筛网过滤，用 Hanks 液洗 3 次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于 2ml 的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数（应在 95%以上） ，最后用 RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度为1107个/mL。5.8.
17、2.3.3 NK 细胞活性测定在 96 孔培养板中每孔加 100l 标记的靶细胞，实验孔加 100l 效应细胞，空白对照孔加 100l 培养液，最大释放孔加 100l 2.5% Triton X-100。每个样品设 3 个复孔，置 5%CO2、37培养箱内温育 4h，用多头细胞收集器将细胞收集在玻璃纤维滤纸上，用液体闪烁仪进行测量。 按下式计算 NK 细胞活性： 实验孔 cpm NK 细胞活性%=(1 ) 100%空白对照孔 cpm 最大释放孔 cpm5.8.2.4 数据处理及结果判定NK 细胞活性需进行数据转换，XSin -1 ，式中 P 为 NK 细胞活性，用p小数表示。在进行方差分析时，
18、需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方26差齐，计算 F 值，F 值 F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F 值F 0.05,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。受试样品组的 NK 细胞活性显著高于对照组的 NK 细胞活性，可判定该项实验结果阳性。5.9 增强免疫力功能结果判定：5.9.1 经正常动物实验，受试样品具有增强免疫力作用。在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能及 NK 细胞活性四个方
19、面测定中，任两个方面试验结果为阳性，可以判定该受试样品具有增强免疫力作用。其中细胞免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定细胞免疫功能试验结果阳性。体液免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定体液免疫功能试验结果阳性。单核巨噬细胞功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定单核巨噬细胞功能试验结果阳性。NK 细胞活性测定实验的一个以上剂量结果阳性，判定 NK 细胞活性结果阳性。正常动物实验需进行四个方面的测定。5.9.2 经免疫功能低下动物实验，受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作用。在免疫功能低下模型成立条件下，血液白细胞总数、细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能及 N
20、K 细胞活性五个方面测定中，任两个方面试验结果为阳性，判定该受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作用。其中细胞免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能试验结果阳性。体液免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能试验结果阳性。单核巨噬细胞功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核巨噬细胞功能试验结果阳性。NK 细胞活性测定实验的一个以上剂量结果阳性，可以判定 NK27细胞活性结果阳性。血液白细胞总数测定的二个剂量结果阳性，可以判定血液白细胞总数结果阳
21、性。免疫功能低下模型动物实验需进行任三个方面项目的测定。同时在各项实验中，所测项目都不出现加重免疫抑制剂作用的结果（表现为一个以上剂量组低于模型对照组，P0.05） 。28增强免疫力功能评价方法修订说明一、承担单位广东省疾病预防控制中心为主要承担单位，本次任务来源于国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司的委托，对保健食品检验与评价技术规范（2003 年版） 中“增强免疫力功能评价程序和检验方法”进行修订。二、主要工作过程国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司于 2009 年 4 月召开了“保健食品功能评方法及有关程序修订”课题协作组工作会议，参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所
22、、广东省疾病预防控制中心、上海市疾病预防与控制中心、北京市疾病预防控制中心、四川大学华西公共卫生学院、中国中医研究院东直门医院和国家食品药品监督管理局保健食品审评中心的专家近 15人，会上对“保健食品功能评价方法及有关程序修订”修订的原则和框架作了充分的讨论，又分别征求了相关专家对修订内容的意见。为了做好本次检验方法的修订工作，广东省疾病预防控制中心成立了“增强免疫力功能评价程序和检验方法”修订的起草工作小组，经查阅国内外相关资料，参考国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司召开的工作会议的精神，咨询有关专家和实验室同行的意见和建议，形成了本次任务的工作方案，总体上要提高检验方法的科学性、准
23、确性和客观性，提高保健食品功能的技术标准。本次修订主要工作：建立和完善免疫低下模型方法，增加总体免疫功能评价方法指标，增加应用 Brdu 掺入标记法检测 LPS 和 ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化功能方法，增加单核-巨噬细胞吞噬荧光微球试验方法，改良发型变态反应（DTH）测量方法，形成“增强免疫力功能”评价检验方法修改，在此基础上提出相应的判定标准。经过起草工作小组开展的大量条件探索和实验方法研究，对各种实验结果进行了比较和取舍，形成了修订初稿后，起草工作小组召开了多次专家研讨会，征求专家意见，对初稿进行了反复修改，形成征求意见稿。方法验证工作由广东省疾病预防控制中心、湖南省疾病预防控制中心
24、、湖北省疾病预防控制中心、29福建省疾病预防控制中心分别进行验证试验。在此基础上，征集、整理和归纳了相关意见和建议。国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司于 2010 年 8 月再次召开了“保健食品功能评价方法及有关程序修订”课题协作组工作会议，参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、广东省疾病预防控制中心、上海市疾病预防与控制中心、北京市疾病预防控制中心、四川大学华西公共卫生学院、中国中医研究院西苑医院的专家近 10 人，会上针对验证过程中存在的技术问题及可操作性作了充分讨论并提出修改意见，起草工作小组根据会议精神对修订方案做了进一步完善，并邀请北京市疾病预防控制中心进行部分项目的
25、验证，综合了方法验证单位的意见后形成了征求意见稿。2011 年 7 月 22 日国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司在北京宣武门商务酒店召开了“保健食品功能评价方法及有关程序修订”定稿专家研讨会，参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、北京大学、广东省疾病预防控制中心、北京市疾病预防控制中心、上海市疾病预防控制中心、中国中药研究院、中国中医研究院西苑医院、北京医院、国家食品药品监督管理局保健食品审评中心的专家 14 人，会上对修订后的“增强免疫力功能评价程序和检验方法”的科学性、客观性和可操作性给予肯定，并提出修改意见，对征求意见稿做了进一步完善。三、编制原则1、总原则，提高保健食
26、品“增强免疫力功能评价程序和检验方法”的科学性、准确性和规范性，适应当前法规对加强保健食品监管的要求。2、修订内容要符合当前增强免疫力功能评价的基础理论，既考虑原规范合理的方法，又要提高保健食品功能检验的技术标准，选择保留、改良或新增加的指标要在国内外已经广泛应用并得到普遍的认可，可以反映保健食品增强免疫力的功能作用。3、在撰写过程中，注意科学性、合理性、和适用性。四、确定相关技术内容及新旧方法的对比30原方法 现方法编号 序号 内容 序号 内容修订理由1 1 原理 增加“原理”条款，概括了实验原理2 1 实验动物 2 实验动物选择 更改标题及序号，详细描述原方法内容3 2 剂量分组及受试样品
27、给予时间3 剂量分组及受试样品给予时间更改标题序号，增加免疫低下模型法分组内容4 4 免疫功能低下动物模型增加建立免疫功能低下动物模型的详细方法 5 5.1 外周血白细胞测定 增加“外周血白细胞测定”内容6 3.1.1.3.2 脾细胞悬液制备5.2.1.3.2 脾细胞悬液制备 更改标题序号，对原方法内容进行了简化7 5.2.2 XTT 法 增加 XTT 法内容8 5.2.3 溴脱氧尿嘧啶核苷标记酶联免疫吸附测定法(BrdU-ELISA 法)增加“溴脱氧尿嘧啶核苷标记酶联免疫吸附测定法(BrdU-ELISA 法)”内容9 3.1.1.4 同位素渗入法取消方法10 3.2.2.2 材料 5.3.2
28、.2 材料 更改标题序号，增加足趾容积测量仪为测量仪器11 3.2.2.3.2 DTH 的产生与测定5.3.2.3.2 DTH 的产生与测定 更改标题序号，引入肿胀度作为仪器测量的指标12 3.2.2.4 数据处理和结果判定5.3.2.4 数据处理和结果判定 更改标题序号，引入肿胀度指标13 3.3 抗体生成细胞检测（Jerne 改良玻片法）5.4 抗体生成细胞检测（改良法）更改标题及序号，对原方法进行改良14 3.3.2 仪器和材料 5.4.2 仪器和材料 更改标题序号，增加溶血空斑自动图象分析仪及 SA 缓冲液具体配方15 3.3.3.1 SRBC 5.4.3.1 SRBC 增加了羊血洗涤的操作方法16 5.4.3.2 完全培养基的制备 增加了完全培养基的制备方法17 5.4.3.3 补体制备 增加了补体制备具体操作方法18 3.3.3.3 玻片涂膜 取消
