1、实验三十二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量1、实验目的了解 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的原理，并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子质量。2、实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。SDS 是十二烷基磺酸钠的简称，它是一种阴离子去垢剂，它能按一定的比例与蛋白质结合成负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分
2、子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子质量的对数与迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）可以用圆盘电泳，也可以用垂直平板电泳，本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较。三、实验材料、仪器和试剂1实验仪器：（1）直流稳压电泳仪（2）垂直平板电泳槽（3）移液器（1.0ml、200l、20l）（4）微量注射器（20l）（5）烧杯、试管、滴管、直尺2实验试剂：（1） 凝胶贮备液（C 液）：丙烯酰胺（Acr）29.2g，亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加重蒸水至 100ml。外包锡纸，4冰箱保存，30 天以内使用。（2）
3、分离胶缓冲液（A 液）： 1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。18.15g Tris（三羟甲基氨基甲烷） ，0.4gSDS，加约 80ml 重蒸水，用 1mol/L HCl 调 pH到 8.8，用重蒸水稀释至最终体积为 100ml，4冰箱保存。（3）浓缩胶缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl 调至 pH6.8，用重蒸水稀释至最终体积为100ml，4冰箱保存。6.06g Tris，0.4gSDS，加约 80ml 重蒸水，用 1mol/L HCl 调 pH 到 6.8，用重蒸水稀释至最终体积为 100ml，4冰箱保存。（4）过硫酸铵（D 液）:10%过硫酸铵。0.1g 过硫酸铵加
4、 H2O 到 1ml。须新鲜配制。（5）10%SDS，室温保存。（6）两类样品缓冲液：2 倍还原缓冲液（2reducing buffer）表 25 还原缓冲液加样表0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8 2.5ml甘油 2.0ml质量浓度 10%SDS 4.0ml质量浓度 0.1%溴酚蓝 0.5ml-巯基乙醇 1.0ml总体积 10ml2 倍非还原缓冲液（2non-reducing buffer）表 26 非还原缓冲液加样表重蒸水 1.0ml0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8 2.5ml甘油 2.0ml质量浓度 10%SDS 4.0ml质量浓度 0.1%溴酚蓝 0.5ml总
5、体积 10ml（7）Tris-甘氨酸电极缓冲液，pH8.3Tris 3g，甘氨酸 14.4g，SDS1.0g，调 pH8.3，加重蒸水至 1000ml，4 冰箱保存。（8）低相对分子质量标准蛋白质，开封后溶于 200L重蒸水，加 200L 2 倍样品缓冲液（还原缓冲液） ，分装 20 小管，-20 保存。临用前沸水浴 35min。其相对分子质量（M r）如下：表 27 低相对分子质量标准蛋白质表标准蛋白质 Mr兔磷酸化酶 B 97400牛血清白蛋白 66200兔肌动蛋白 43000牛碳酸酐酶 31000胰蛋白酶抑制剂 20100鸡蛋清溶菌酶 14400（9）染色液：0.25g 考马斯亮蓝 R2
6、50，加入 91ml 50%甲醇， 9ml 冰醋酸。（10）脱色液：50ml 甲醇，75ml 冰醋酸与 875ml 重蒸水混合。（11）待测相对分子质量的样品4、实验操作步骤1.将垂直平板电泳槽装好。2.分离胶的选择和配制方法（1）按照蛋白质不同的相对分子质量选用不同浓度的分离胶。表 28 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围蛋白质相对分子质量的范围 分离胶的浓度(丙烯酰胺质量分数/%)12 00043 000 15%16 00068 000 10%36 00094 000 7.5%57 000212 000 5%（2）不同分离胶的配制方法表 29 分离胶配制表3.分离胶的灌制根据待测蛋白质样
7、品的相对分子质量选择合适的分离胶浓度，本实验选用血管内皮细胞生长因子（VEGF）为待测相对分子质量的样品，用 12%的分离胶。在 15ml 试管中依次加入重蒸水 3.35ml、1.5mol/L Tris-HCl （pH8.8）缓冲液2.5ml、10%SDS 0.1ml、凝胶贮备液 4.0ml、10% 过硫酸铵 50L和 TEMED 5L，由于加入TEMED 后凝胶就开始聚合，所以应立即混匀混合液，然后用滴管吸取分离胶，在电泳槽分离胶的浓度 20% 15% 12% 10.2% 7.5%重蒸水/ml 0.75 2.35 3.35 4.05 4.851.5mol/LTris-HCl（pH8.8）/m
8、l 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5质量浓度为 10%SDS/ml 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1凝胶贮备液（Acr/Bis）/ml 6.6 5.0 4.0 3.3 2.5质量浓度为 10%过硫酸铵/L 50 50 50 50 50TEMED/L 5 5 5 5 5总体积/ml 10 10 10 10 10的两玻璃板之间灌注，留出梳齿的齿高加 1cm 的空间以便灌注浓缩胶，用滴管小心地在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下约 3060min，分离胶则聚合，待分离胶聚合完全后，除去覆盖的重蒸水，尽可能去除干净。4.浓缩胶的配制和灌制一般采用 5%的浓缩胶，配制方法：重蒸水
9、 2.92ml、0.5mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH6.8）1.25ml、10%SDS0.05ml 、凝胶贮备液（Acr-Bis）0.8ml 、10%过硫酸铵25L、TEMED 5L，早试管中混匀，灌注在分离胶上。小心插入梳齿，避免混入气泡，将电泳槽垂直静置于室温下至浓缩胶完全聚合（约 30min） 。5.样品的制备（1）标准蛋白质样品的制备取出一管预先分装好的 20L低相对分子质量标准蛋白质，放入沸水浴中加热35min，取出冷至室温。（2）待测蛋白质样品的制备10l VEGF（约含 5g VEGF）加 10l 2 倍还原缓冲液。10l VEGF（约含 5g VEGF）加 10l
10、2 倍非还原缓冲液。以上 、 两管均同标准蛋白质样品一样，在沸水浴中加热 35min，取出冷却至室温。6.电泳（1）待浓缩胶完全聚合后，小心拔出梳齿，用电极缓冲液冲洗加样孔（梳孔）数次，然后将电泳槽注满电极缓冲液。（2）用微量注射器按号向凝胶梳孔内加样。（3）接上电泳仪，上电极接电源的负极，下电极接电源的正极。打开电泳仪电源开关，调电流至 2030mA 并保持电流强度恒定。待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约 1cm 时，停止电泳。7.染色与脱色小心将胶取出，置于一大培养皿中，在溴酚蓝条带的中心插一细钢丝作为标志。加染色液染色 1h，倾出染色液，加入脱色液，1 吃 v223 次脱色液，直至背景清晰。5、计算用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心以及钢丝距分离胶顶端的距离，按下式计算相对迁移率： cm=样 品 迁 移 距 离 （ ）相 对 迁 移 率 染 料 迁 移 距 离 （ ）以标准蛋白质 Mr 的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查出相对分子质量。
