1、1酿造学实验教案教案首页教授时间 2013-2014-01 学期 教案编写时间 2013 年 9 月 课程代码课程名称 酿造学实验学分 0.5课程性质 必修课（ ） 选修课（） 理论课（ ） 实验课（ ）任课教师 周念波 职称 讲师总学时：32实验：8 学时实习： 周授课对象 生物科技系 10 生物技术专业教材和主要参考资料参考资料：1 发酵工程教研室编 . 酿造学实验 . 校内讲义, 2013.2 李阜棣, 俞子牛 , 何绍江 . 农业微生物实验技术. 北京: 中国农业出版社, 1996.3 W.F.Harrigan. 食品微生物实验手册. 北京: 中国轻工业出版社, 2004.4 黄方一,
2、 叶 斌. 发酵工程 . 武汉: 华中师范大学出版社, 2006.5 吴根福. 发酵工程实验指导. 北京: 高等教育出版社, 2006.6 汪穗福. 微生物检验验证技术. 北京: 中国医药科技出版社, 2006.7 葛向阳, 田焕章 , 梁运祥 . 酿造学. 北京: 高等教育出版社, 2005.8 邱立友. 发酵工程设备 . 北京: 中国农业出版社, 2007.9 邱立友. 发酵工程设备实验. 北京: 中国农业出版社, 2008.10 陈长华. 发酵工程实验 . 北京: 高等教育出版社, 2009.参考国家级精品课程网站：1 http:/ http:/ http:/ http:/ http:/
3、 http:/ 实验项目 学时 实验性质 备注1 酱油曲霉斜面活化酱油曲霉三角瓶固态培养 4 综合性实验 实验操作2 酱油种曲质量检验测曲霉孢子数 4 综合性实验 实验操作3实验项目 实验一 酱油曲霉斜面活化及米曲霉三角瓶固态培养 4 学时）实验性质 综合性实验教学目的和要求1. 学习制备综合马铃薯葡萄糖培养基的方法以及斜面接种技术。2. 掌握常见菌种斜面活化方法。3. 掌握固态培养技术的基本原理。4. 学习产蛋白酶米曲霉固态三角瓶培养的具体方法。教学重点与难点重点：学习制备马铃薯葡萄糖培养基的方法以及斜面接种技术学习产蛋白酶米曲霉固态三角瓶培养的具体方法难点：掌握常见菌种斜面活化方法固态培养
4、技术的基本原理实验仪器与试剂1. 菌种：米曲霉菌株，由前实验得到。2. 三角瓶培养基：麸皮 80g，面粉 20g，水 8085mL，250mL 三角瓶湿料 20g，0.1MPa 灭菌30min。3. 仪器：灭菌锅，真菌培养箱、天平、 500ml 刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、18ml180ml 试管、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。教学进程（一）酱油曲霉斜面活化实验原理讲解实验步骤：1. 综合马铃薯培养基的制备（1）称量去皮新鲜马铃薯 20g 切成 1cm 见方小块，放入烧杯中，加100mL150mL 自来水，置电炉上煮沸 20min 后，用双层纱布过滤，取滤液备用。（2）加
5、入称好的 2g 琼脂，加热搅拌至琼脂完全熔化，再加入称好的 2g 葡萄糖、0.3g KH 2PO4、0.15g MgSO 47H2O、0.8mg 硫胺素等成分，补水至100mL，并调 pH 至 6.0。趁热分装于 18ml180ml 试管，斜面以 8mL10 mL 为宜（摆出来的斜面不超过试管的 1/2） 。（3）分装完毕后，塞好棉塞并将试管（7 支一扎）捆扎好，121灭菌20min，灭菌后趁热摆斜面。2. 分离纯化菌株转接斜面（斜面接种）接种是将纯种微生物，在无菌操作条件下，移植到已灭菌并适宜该菌生长繁殖所需要的培养基中。为了获得微生物的纯种培养，要求接种过程中必须严格进行无菌操作。一般是在
6、无菌室内，超净工作台或实验台酒精灯火焰旁进行。（1）将米曲霉的保藏斜面至常温下或 30左右的培养箱中 46h。（2）左手拿平板，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻。（3）左手将平板放下，拿起斜面培养基。在火焰旁用右手小指和手掌边缘拔下棉塞并夹紧，迅速将接种环伸入空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。划线时由底部向上划一直线，一直划到斜面的顶部。注意勿将培养基划破，不要使菌体沾污管壁。（4）灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上。接种完毕，接种环上的余菌必须灼烧灭菌后才能放下。（5）斜面置于 2830恒温箱中，培养 57d 观察结果。
7、本实验旨在培养学生扎实过硬的斜面活化操作技术。通过细节的讲解和示范，熟练掌握综合马铃薯培养基的制备方法和斜面接种技术，以及种曲制备内容的理解。培养学生对固态发酵的认识和理解。让学生熟知固态发酵技术的关键控制点。示范操作4（二）米曲霉三角瓶固态培养实验原理：种曲制备流程：菌种斜面试管培养三角瓶培养种曲（扩大培养） 。三角瓶固态培养技术小规模制得种曲的种子，供种曲生产接种所用。培养基物料比例，无机盐的含量，料水比，培养时间等因素对制备三角瓶种子有较大影响。实验步骤：1. 先将称好的麸皮和面粉充分混匀，加入适量水（计量体积） ，拌合均匀。2. 分装 250mL 的三角瓶中，每瓶装料 20g（厚度为
8、12cm） ，八层纱布或棉塞封口，121，灭菌 30min。3. 灭菌后趁热摇散，冷却后接入 1 环活化后的米曲霉试管斜面菌种，置2830恒温培养 72h，期间摇瓶 2 次，扣瓶 1 次。4. 待菌丝生长旺盛、孢子丛生即可取出放入冰箱中，作为曲种备用。实验现象描述思考题思考题1. 简述米曲霉纯种培养操作过程中的关键无菌操作技术。2. 描述米曲霉斜面菌落生长特征。3. 观察并描述每天米曲霉生长情况和曲料颜色变化。4. 如何评价三角瓶培养物的感官指标和理化指标？课后总结分析5实验项目 实验二 曲种质量检验血球计数板测定孢子数 （4 学时）实验性质 综合性实验教学目的和要求学会孢子悬液的制备方法。掌
9、握应用血球计数板测定孢子数方法。教学重点与难点重点：血球计数板制板及计数规则难点：计算公式的推导实验仪器与试剂1. 生产菌株：米曲霉三角瓶孢子种（由上实验获得） 。2. 试剂：95%酒精、稀硫酸（ 1:10） 、无菌水。3. 仪器：显微镜、血球计数仪、载玻片、盖片、旋转式摇床、250mL 和 500mL 锥形瓶等。教学进程实验原理：种曲质量要求之一是含有足够的孢子数量，孢子旺盛、活力强、发芽率高，所以孢子数及其发芽率的测定是种曲质量控制的重要手段。种曲质量标准如下：指 标 二级指标 指标要求外观 菌丝整齐健壮、孢子旺盛、米曲霉呈新鲜黄绿色，黑曲霉呈新鲜黑褐色。无夹心，无杂菌、无异色。香气 具有
10、种曲固有的曲香、无霉味、酸味、氨味等不良的气味。感官指标手感 用手指触及种曲，松软而光滑，孢子飞扬。孢子数 60 亿/g（以干基计）以上发芽率 90以上理化指 标细菌数 不超过 107 个/g（三角瓶孢子细菌数不得检出）目前测定微生物数量方法均采用传统的稀释平板法，此方法测定细菌、酵母菌等单细胞菌类完全适宜，在重现性和准确性上均可达到精度要求。对于酿造工业测定曲霉菌等真菌孢子来讲，可以采用传统稀释平板法和血球计数板直接计数等方法测定。实验步骤：流程： 曲种称量稀释过滤定容制计数板观察计数计算（1）精确称取三角瓶种曲 1g（称准至 0.001g） ，倒入盛有玻璃珠的 250mL三角瓶内，加入 9
11、5%酒精 5mL、无菌水 20mL、稀硫酸（1:10）10mL ，在摇床上充分振摇（2030min） ，使种曲孢子分散，然后用三层纱布过滤，用无菌水反复冲洗，使滤渣不含孢子，最后稀释至 500mL。 （2）制计数板取洁净干燥（如何清洁？）的血球计数板盖上盖玻片，用无菌滴管取孢子稀释液 1 小滴滴于盖玻片的边缘处（不宜过多） ，让滴液自行渗入计数室中，注意不可有气泡产生。若有多余液滴，可用吸水纸吸干，静止 35min，待孢子沉降。（3）观察计数本实验通过血球计数板的使用，掌握血球计数板计数技术。并通过显微镜观察孢子形态特征及特点。熟练掌握孢子悬液制备技术和血球计数板制板技术。6用低倍镜头和高倍镜
12、头观察，由于稀释液中的孢子在血球计数板上处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而计数时必须逐格调动微调螺旋，才能不使之遗漏。注意：（1）如孢子位于格的线上，数上线不数下线，数左线不数右线。（2）样品稀释至每个小格所含孢子数在 10 个以内较适宜，过多不易计数，应进行稀释调整。使用 1625 规格的计数板时，只计板上四个角上的 4 个中格（即 100 个小格）。如果使用 2516 规格的计数板时，除计四个角上的 4 个中格外，还需要计中央一个中格的数目（即 80 个小格，如上图） 。每个样品重复观察计数不少于 2 次，然后取其平均值。2516 的计数板孢子数计算方法如下： 孢子数（个/g）= （N/80 ）40010000（V/G ）= 5104（NV/G）式中：N80 小格内孢子总数（个） ；V孢子稀释液体积（ml） ；G样品重量（g） 。 思考题1. 用血球计数板孢子计数有何优缺点？2. 本方法测定的孢子数和用平板计数法测定的孢子数有何区别。课后总结分析6
