1、 叶酸代谢 能力 （ MTHFR） 基因型检测 1. 项目名称： 叶酸代谢 能力 （ MTHFR） 基因型检测 2. 实验原理： 应用一对双标记 Taqman 探针，分别针对双等位 SNP 的不同基因型，只有完全匹配的探针扩增出各自对应的基因型；用两种荧光染料 Fam， Hex（ Vic）分别标记这两种探针，就可以在一次 PCR 反应中完成对单个 SNP 位点的基因型判定。 3. 试剂： 3.1 TIANGEN 血液基因组 DNA提取试剂盒（ TIANamp Blood DNA Kit DP318） ，规格 为 50次 /盒 ，保存于室温。有效期 12个月，在效期内使用试剂。 名称 含量 名称
2、 含量 细胞裂解液 CL 60 ml 洗脱缓冲液 TB 15 ml 缓冲液 GS 15 ml Proteinase K 1 ml 缓冲液 GB 15 ml 吸附柱 CB3 50 个 缓冲液 GD 13 ml 收集管 50 个 漂洗液 PW 15 ml 1.5 50 个 3.2 江西 诺德医疗器械有限公司的叶酸代谢能力测定试剂盒 ，规格为 200 测试 /盒（ 6 l 体系，如 20 l 体系则为 50 测试）， -20 保存。有效期 12 个月，在有效期内使用。 名称 成分 含量 荧光基团预混液 MTHFR A1298C 位点试剂 1 ml 荧光基团预混液 MTHFR C677T 位点试剂 1
3、 ml 纯化水 阴性 1 ml 阳性样本 1-A MTHFR A1298C-CC（突变纯合） 60 阳性样本 1-B MTHFR A1298C-AC（突变杂合） 60 阳性样本 1-C MTHFR A1298C-AA（野生型） 60 阳性样本 2-A MTHFR C677T-CC（野生型） 60 阳性样本 2-B MTHFR C677T-CT（突变杂合） 60 阳性样本 2-C MTHFR C677T-TT （突变纯合） 60 4. 仪器： 4.1 离心机 4.2 荧光 定量 PCR 仪 5. 方法： Taqman 探针法 6. 操作步骤： 6.1 对标本进行编号，并录入 LIS 系统； 6.
4、2 样本处理 : 使用前先在缓冲液 GD 和漂洗液 PW 中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。 6.2.1 在离心管中加入 200 L 血液 ： 6.2.2 加入 20 l Proteinase K 溶液，混匀。 6.2.3 加 200 l 缓冲液 GB，充分颠倒混匀， 56放置 10 min，其间颠倒混匀数次 。 （ 水浴后颜色可能为深褐色，注意溶液中没有团块等沉淀。 ） 6.2.4 加 200 l 无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。 6.2.5 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱 CB3 中（吸附柱 CB3 放入收集管中）， 12,000 rpm(13,400
5、g)离心 30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CB3 放入收集管中。 6.2.6 向吸附柱 CB3中加入 500 l缓 冲液 GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm(13,400 g)离心 30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CB3 放入收集管中。 6.2.7 向吸附柱 CB3 中加入 600 l 漂洗液 PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm(13,400 g)离心 30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CB3 放入收集管中。 6.2.8 重复操作步骤 7。 6.2.9 12,000 rpm(13,400 g)离心 2 m
6、in，倒掉废液。将吸附柱 CB3 置于室温放置数分钟，以彻底晾干 吸附材料中残余的漂洗液。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应实验。 6.2.10 将吸附柱 CB3 转入 1.5 ml 离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加 50 l 洗脱缓冲液 TB，室温放 置 2-5 min， 12,000 rpm(13,400 g)离心 2 min，将溶液收集到离心管中。 6.3 分型检测 ： 6.3.1 分装：每个位点分装 19 L（ 20 L 体系）待测位点的反应液于反应管中，分装管数为 n+4（ n 为样本数， 4 为 3 个阳性质控 +1 个阴性质控
7、）。 6.3.2 加样：向分装好试剂的反应管内分别加入 1 L 待测模板、阴性 /阳性。 注意：叶酸试剂盒为 2 个位点， 2 个位点需要分别进行以上操作。 单个位点分装如下图： 6.3.3 上机 按照以下条件进行扩增： 95 10 min， 95 15s、 60 45s 进行 40。 个循环， 60采集荧光。 6.4 根据图像， 进行结果判读，并记录结果，上传报告。 6.5 关机器，关电脑。 6.6 审核报告。 6.7 操作流程图 准备 开电脑 对标本进行分类编号，并录入 LIS 系统 DNA 提取 分型实验 RCR 扩增 （ 95 10 min， 95 15s、 60 45s 进行 40
8、个循环 ） 结果判读 上传结果 7 质量控制： 7.1 如遇检测结果阴性必须重复检测。 7.2 实验有效性：阳性对照检测为 A1298C、 C677T 至少 2 个显示为阳性则分型检测结果有效。 8.检验结果解释 叶酸代谢能力测定试剂盒 命名 检测信号对应碱基氨基酸情况 FAM VIC Rs 氨基酸 碱基 氨基酸 碱基 氨基酸 碱基 位置 rs1801131 E429A A1298C Glu A(野生型 ) Ala C(突变型 ) 位置 rs1801133 A222V C677T Val T(突变型 ) Ala C(野生型 ) 9.性能指标： 9.1 批内差 CV 10% 9.2 批间差 CV
9、 10% 9.3 最低检测限 5ng/ L 9.4 外观：应光滑平整，无油污、异物、毛边、破裂、杂质等，口盖螺纹清晰、配合适宜。 10.方法局限性： 10.1 不能直接作为临床确诊依据，仅供临床医生参考使用。 11.临床意义： 叶酸 (Folic acid)是一种广泛分布的 B族维生素。叶酸的名字来源于拉丁文 folium(叶子 )。由米切尔 (H K Mitchell， 1941)及其同事首次从菠菜叶中提取纯化出来。 叶酸是一种水溶性 B 族维生素， 叶酸作为重要的一碳载体，在核苷酸合成，同型半胱氨酸的再甲基化等诸多重要生理代谢功能方面有重要作用。因此叶酸在快速的细胞分裂和生长过程 (如婴儿
10、发育、怀孕 )中有尤其重要的作用。叶酸能促进骨髓中的幼细胞发育成熟形成正常形态的红细胞。叶酸缺乏会造成诸多疾病，如新生儿的三体综合征、唇腭裂、神经管缺陷、脊柱裂、先天性心脏病以及孕妇习惯性流产等。叶酸代谢中重要的酶是亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolate reductase , MTHFR)，它是体内转移 “一碳基团 “过程中重要的辅酶，其携带各种一碳基团从而参与体内一些重要生化反应：如参与胸腺嘧啶核苷酸和嘌呤的合成，尿嘧啶脱氧核苷酸 (dUMP)和 N5.10-甲烯基四氢叶酸形成胸腺嘧啶核苷酸 (dTMP)和二氢叶酸。其中 dTMP 是合成 DNA 重要原料
11、：参与嘌呤环中碳 2 及 8 的合成；参与蛋氨酸的合成，将 N5 甲基四氢叶酸的甲基转移到同型半胱氨酸，形成蛋氨酸。研究发现 A1298C、 C677T两个多态性变化能 反应亚甲基四氢叶酸还原酶的活性。 12. 标本采集及处理： 12.1 检测标本种类要求：静脉血 EDTA 抗凝血标本可作为检测标本。 12.2 受检者准备：受检者无需做特殊准备； 12.3 标本采集及处理：静脉血 1ml，加入到 EDTA 抗凝管中。 12.4 标本保存：室温保存不超过 7 天， 2-8 保存不超过 1 个月， -20 保存不超过 7 周，反复冻融不超过 5 次。 12.5 标本容器： 盛放标本的容器必须为洁净
12、的一次性 EDTA 抗凝采血管 。 12.6 标本拒收： 凡与以上所述内容不符的标本，检验人员应向临床或就诊者说明拒收标本的原因，并提出解决的方案或建议。 13. 注意事项 13.1 本产品可用于体外诊断用途。 13.2 开始检测前请仔细阅读本说明书全文。 13.3 整个检测过程应分为三区进行：一区进行试验分装；二区进行样本处理、加样等；三区进行扩增反应，杂交实验、检测及结果分析；各区的仪器设备应独立使用。 13.4 在操作中，应使用一次性手套（经常更换），一次性 PCR 专用离心管、移液器头。 13.5 操作人员应经过专业培训。 13.6 操作完样品和试剂后要充分洗手，避免皮肤、眼睛或黏膜直接接触这些材料，如果存在接触，迅速用大量的水冲洗。如果这些材料溅出，在擦干前用水稀释。 13.7 当从试剂瓶中移液时，避免与含核酸酶试剂接触。 13.8 样品的防护处理如同传染物处理，使用安全实验室方法处理，用新鲜制备的 0.5%盐酸次氯酸钠去离子水或蒸馏水溶液彻底清洁和消毒所有工作物表面。 14. 参考文献 14.1 临床检验操作规程 编写要求（ WS/T227-2002） 14.2 试剂盒中的试剂说明书
