1、外源性 DNA 残留量测定法在进行外源性 DNA 残留量测定时，可根据供试品具体情况选择下列任何一种方法进行测定。第二法 荧光染色法应用双链 DNA 荧光染料与双链 DNA 特异结合形成复合物，在波长 480nm 激发下产生超强荧光信号，可用荧光酶标仪在波长 520nm 出进行检测，在一定的 DNA 浓度范围内以及在该荧光染料过量的情况下，荧光强度与 DNA 浓度成正比，根据供试品的荧光强度，计算供试品中的 DNA 残留量。试剂：1. 1mol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH7.5） 用盐酸调 pH 至 7.5。2. 0.5mol/L 乙二胺四乙酸二钠溶液（pH7.5） 用 10m
2、ol/L 的 NaOH 溶液调 pH 至7.5。3. TE 缓冲液（pH7.5） 1mol/L Tris 溶液（pH7.5）1.0ml 、0.5mol/L 乙二胺四乙酸二钠溶液（pH7.5）0.2ml，加灭菌水至 100ml。4. 双链 DNA 荧光染料 按试剂使用说明配置5. DNA 标准品 取适量 DNA 标准品溶于 TE 缓冲液中，制成 100g/ml DNA 标准品，于-20 保存。DNA 标准品浓度计算：DNA 浓度（g/ml ）=50 x A 260DNA 标准品溶液制备 用 TE 缓冲液将 DNA 标准品配成0ng/ml、 1.25ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、
3、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml 、80ng/ml 的标准品溶液。测定法：1. 精密量取 DNA 标准品溶液和供试品溶液各 400l 于 1.5ml 离心管中，分别加入新配制的双链 DNA 荧光染料 400l，混匀，避光室温放置 5min。2. 取 250l 上述反应液于 96 孔黑色酶标板中，并作 3 个复孔。用荧光酶标仪在激发波长 480nm、发射波长 520nm 处测定荧光强度。3. 以 TE 缓冲液测得的荧光强度为本底，测定和记录各测定孔的荧光值。以标准品溶液的浓度对其相应的荧光强度作直线回归，求得直线回归方程（相关系数应不低于 0.99） ，将供试品溶液的荧光强度代入直
4、线回归方程，求出供试品中 DNA 残留量。注意事项：1. DNA 残留量在 1.2580ng/ml 内，本法线性较好，供试品 DNA 残留量在该范围内可定量测定；当 DNA 残留量低于 1.25ng/ml 时应为限量测定，表示为小于1.25ng/ml。2. 供试品首次应用本法测定时需要进行方法学验证，验证内容至少包括精密度试验和回收率试验。若供试品干扰回收率和精密度，应采用适宜方法稀释或纯化 DNA（参见本项目第一法）以排除干扰。需要纯化 DNA 后再进行测定的供试品，每次测定均应从纯化步骤起增加回收率试验，并用回收率对测定结果进行校正。第一法 DNA 探针杂交法供试品中的外源性 DNA 经变
5、性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的单链 DNA 复性而重新结合成为双链 DNA，称为杂交。将特异性单链 DNA 探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链 DNA 杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性 DNA 对照比对后，可测定供试品中外源性 DNA 残留量。试剂 （1）DNA 标记和检测试剂盒（2）DNA 杂交膜 尼龙膜或硝酸纤维素膜（3）2%蛋白酶 K 溶液 称取蛋白酶 K 0.20g，溶于灭菌水（电阻率大于 18.2Mcm）10ml 中，分装后储藏于-20 备用。（4）3%牛血清白蛋白溶液 称取牛血清白蛋白 0.30g，溶于灭菌水（电阻率大于18
6、.2Mcm）10ml 中，分装后储藏于-20备用。（5）1mol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH8.0） 用盐酸调 pH 至 8.0。（6）5.0mol/L NaCl 溶液。（7）0.5mol/L 乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0） NaOH 溶液调 pH 至 8.0。（8）20%十二烷基硫酸钠（ SDS）溶液 用盐酸调 pH 至 7.2。（9）蛋白酶缓冲液（pH8.0） 量取 1mol/L Tris 溶液 1.0ml（pH8.0） 、5.0mol/L NaCl溶液 2.0ml、0.5mol/L 乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0 ）2.0ml、20%SDS 溶液 2.5ml，加灭菌
7、水至 10ml。（10）TE 缓冲液（pH8.0） 1mol/L Tris 溶液（pH8.0）1.0ml 、0.5mol/L 乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2.0ml，加灭菌水至 1000ml。（11）1%鱼精 DNA 溶液 精密称取鱼精 DNA 0.10g，置 10ml 量瓶中，用 TE 缓冲液稀释至刻度，摇匀。用 7 号针头反复抽打以剪切 DNA 成为小分子，分装后贮藏于-20备用。（12）DNA 稀释液 取 1%鱼精 DNA 溶液 50l，加 TE 缓冲液至 10ml。用于探针标记和阳性对照的 DNA 制备 由生产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交瘤细胞提取纯化获得，其提纯和鉴定可参考
8、以下方案，具体可参考分子克隆实验指南（美 J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002）或精编分子生物学实验指南（美 F.奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，科学出版社，1998） 。1. 将待提取的细胞基质悬浮的细胞浓度调整为 107 个/ml（细菌则为 108 个/ml ） ；2. 量取悬液 1ml，离心，在沉淀中加裂解液 400l 混匀，37作用 1224h；3. 加入饱和苯酚溶液 450l，剧烈混匀，10 000rpm，10min；4. 转移上层液体，以饱和苯酚溶液 450l 重复抽提 1 次；5. 转移上层液体，加入三氯甲烷 450l，剧烈混匀，10 000rpm，10min ；6
9、. 转移上层液体，加入 pH 5.2 的 3mol/L 醋酸钠溶液 40l，充分混匀，再加入-20 以下的无水乙醇 1ml，充分混匀，-20以下作用 2h，15 000rpm，15min ；7. 用适量-20 70%乙醇溶液洗涤沉淀 1 次，15 000rpm ，15min，弃上清；8. 将沉淀吹至干燥后，加适量灭菌 TE 缓冲液溶解，RNase 酶切；9. 酚-三氯甲烷抽提，分子筛纯化 DNA，即得。用 1%琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法鉴定阳性对照品的 DNA 纯度，应无 RNA 和寡核苷酸存在；A 260/A280 比值应在 1.02.0 之间（测定时将供试品稀释至 A260 为 0.21
10、.0）.用于阳性对照和标记探针的 DNA 在使用前应进行酶切或超声处理，使其片段大小适合 DNA 杂交和探针标记。阳性对照品的 DNA 浓度计算：DNA 浓度（g/ml）=50X A 260阳性对照品可分装与适宜的小管中，-20以下保存，长期使用。探针的标记：按说明书进行测定法：1.蛋白酶 K 预处理 按下表对供试品、阳性对照和阴性对照进行加样，混合后 37保温 4h 以上，以保证酶切反应完全。加样量 2%蛋白酶 K 溶液 蛋白酶缓冲液 3%牛血清蛋白溶液 加水至终体积供试品 100l 1l 20l 200lD1 100l 1l 20l 适量 200lD2 100l 1l 20l 适量 200
11、lD3 100l 1l 20l 适量 200l阴性对照 100l 1l 20l 适量 200l根据成品最大使用剂量，用 DNA 稀释液将供试品（原液）稀释至每 100l 含 1 人份剂量；如成品使用剂量较大，而供试品的蛋白质含量较低，可用 DNA 稀释液将供试品稀释至每 100l 含 1/10 或 1/100 人份剂量。D1、D2、D3 为稀释的阳性 DNA 对照。用 DNA 稀释液稀释至每 1ml 中含 DNA 1000ng，然后依次 10 倍稀释成 10ng/100l（D1 ） 、1ng/100l （D2 ） 、100pg/100l（D3）3个稀释度；如成品使用剂量较大，而 DNA 限量要
12、求（100ng/剂量）较严格时，则需要提高DNA 检测灵敏度，相应的阳性 DNA 稀释成 100pg/100l（D1） 、10pg/100l （D2） 、1pg/100l（D3 ） 。阴性对照为 DNA 稀释液，空白对照为未进行蛋白酶 K 预处理的 TE 缓冲液。当供试品 1/100 人份剂量大于 100l 时，终体积也随之增大，一般为供试品体积的 1倍左右，供试品体积和终体积相差过小，可能会影响蛋白酶 K 的活性。2%蛋白酶 K 溶液和蛋白酶缓冲液的比例为 1:20，蛋白酶缓冲液和终体积的比例为1:10。加入 3%牛血清蛋白溶液适量，是为了使阳性对照和阴性对照中含有一定的蛋白质，与供试品（通
13、常为蛋白质）的酶切条件一致；如供试品为其他物质，则改为其他相应物质。若预处理后的供试品溶液中的蛋白质干扰本试验，可用上述饱和苯酚溶液抽提法或其他适宜方法提取供试品 DNA（阳性、阴性对照也应再次提取 DNA，与供试品溶液平行） 。2. 点膜 用 TE 缓冲液浸润杂交膜后，将预处理的供试品、阳性对照、阴性对照与空白对照置 100水浴加入 10min，迅速冰浴冷却，8 000rpm，5s。用抽滤加样器点样于杂交膜（因由蛋白质沉淀，故视沉淀多少确定加样量，避免加入蛋白质沉淀。所有供试品与阳性对照、阳性对照、空白对照加样体积应一致，或按同样比例加样） 。晾干后置 80真空干烤 1h 以上。3. 杂交及显色 按试剂盒使用说明书进行。结果判定：阳性对照应显色，其颜色深度与 DNA 含量相对应，呈一定的颜色梯度；阴性对照、空白对照应不显色，或显色深度小于阳性 DNA 对照 D3，试验成立。将供试品与阳性对照比较，根据显色的深浅判定供试品中外源性 DNA 的含量。
