1、重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体外源性 DNA 残留量测定法(qPCR 法)1 原理实时定量 PCR（qPCR）扩增分 2 个阶段，指数增长阶段和之后出现的非指数平台阶段。在指数增长阶段，每个循环 PCR 产物量大约增加一倍。然而，随着反应的进行，反应体系组成成分的消耗，其中的一种或多种成分限制反应，产物增长速度变慢，反应进入平台期。反应最初，虽然产物呈指数增长，但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增加。但积累了足够的扩增产物，才可检测到的荧光信号，这个循环数叫初始循环数，即 CT。C T 值主要由扩增反应体系中模板的初始浓度决定的。如果模板初始浓度高，只需要较少的扩增循环就可以积累足够
2、的产物，产生高过背景的荧光信号，因此，反应就有一个小或早出现的 CT；相反，如果模板初始浓度低，需要较多的扩增循环才能产生高过背景的荧光信号，反应就有一个大或迟出现的 CT。两者之间关系的建立是 qPCR 用于定量的依据。2 主要仪器表 2 仪器信息表名 称 厂 家 型 号实时定量 PCR 仪 Bio-Rad CFX Connect3 主要试剂表 3 试剂信息表名 称 厂 家 规 格残留 DNA 样品制备试剂盒 ABI1） Lysis Buffer,2 bottles,50ml/bottle;2） Binding Solution,1 empty bottle;3） Wash Buffer C
3、oncentrate, 2 bottles, 26 ml/bottle;4） Elution Buffer; 1 bottle, 25ml;5） Proteinase K (PK) Buffer, 1 bottle, 50ml;6） Magnetic Particles, 2 tubes, 1.5 ml/tube;7） Proteinase K, 2 tubes, 20 mg/ml, 1.25 ml;8） Yeast tRNA, 2 tubes,10mg/ml,0.5ml;Glycogen, 2 tubes,5mg/ml,1.0ml/tube.残留 DNA 定量检测试剂盒（CHO） ABI1)
4、 DNA Control,1 bottle,40l;2) DNA Dilution Buffer(DDB),1 bottle,7ml;3) 2Environmental Master Mix, 2 tubes,0.75ml/tube;4) 10DNA Resl-Time PCR Assay Mix, 1 tube,300l;5) Negative Control, 1 tube,1.0ml.4 溶液配制4.1 蛋白酶 K 混合液（新配）附件 13-14 重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体外源性 DNA 残留量测定法（qPCR ）1 reaction（100l/sample）10 reac
5、tion（100l/sample）Proteinase K 10l 100lProteinase K Buffer 60l 600l4.2 裂解混合液（新配）试 剂 体 积（l）Glycogen（5mg/ml） 180tRNA（10mg/ml） 4Lysis Buffer 7600合 计 77844.3 DNA 标准品稀释Tube label Dilution pg/l pg/ reactionDNA Control 30000 300000SD1 10l DNA Control+990l DDB 300 3000SD2 50l SD1+450l DDB 30 300SD3 50l SD2+4
6、50l DDB 3 30SD4 50l SD3+450l DDB 0.3 3SD5 50l SD4+450l DDB 0.03 0.3SD6 50l SD5+450l DDB 0.003 0.03NTC DDB 0 0注：DNA 标准品溶液 4放置保存 1 天，-20放置保存 1 周。5 测定方法5.1 样品处理5.1.1 除蛋白1）在 2ml 离心管中加入 100l 样品；2）每 100l 的样品中加入 70l 的蛋白酶 K 混合液，混合均匀，56水浴30min；3）每 100l 的样品中加入 360l 的裂解液，室温裂解 2 小时以上。5.1.2 DNA 的纯化1）磁珠使用前于 37温浴
7、10min，高速涡旋，彻底悬浮磁珠；2）每 100l 的样品加入 30l 的磁珠悬浮液；3）每 100l 的样品加入 300l 的 Binding Solution，涡旋混合 5min；4）12000r/min 离心 30sec，将离心管放置于磁力架上，静置 5min 直至溶液清澈，弃上清；5）从磁力架上取下离心管，加入 300l 的 Wash Buffer，涡旋混合 5 sec；6）12000r/min 离心 30sec，将离心管放置于磁力架上，静置 2min，弃上清；7）重复步骤 6）1 次，打开离心管的盖子，室温下风干；8）加入 50l 的 Elution Buffer，高速涡旋 10
8、sec，70处理 10min，在温浴过程中，涡旋 23 次；9）12000r/min 离心 30sec，将离心管放置于磁力架上，静置 2min，将含有洗脱 DNA 的液体转移到新的 1.5ml 的离心管中，用于进行 qPCR 反应。5.2 PCR 反应体系1）标准品、NTC 和样品均做 2 个复孔；2）反应母液用量按表 4 进行计算：表 4 PCR 反应体系Kit Reagents Volume for 1 30-lreaction（l） Volume for 36 30-lreaction（l）Negative Control 2 7210DNA Resl-Time PCR Assay Mi
9、x 3 1082Environmental Master Mix 15 540DNA template 10 N/A合 计 30 7205.3 PCR 仪运行程序设置5.3.1 PCR 反应体系1）标准品、NTC 和样品均做 2 个复孔；2）反应母液用量按表 5 进行计算：表 5 PCR 反应体系Kit Reagents Volume for 1 30-lreaction（l） Volume for 36 30-lreaction（ l）Negative Control 2 7210DNA Resl-Time PCR Assay Mix 3 1082Environmental Master M
10、ix 15 540DNA template 10 N/A合 计 30 7205.2.2 PCR 仪运行程序设置1）荧光基团选择 FAM；2）96 孔反应模块设置见下表，样品根据实际数量依次设置：1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A SD1 SD1 样品 1 样品 1B SD2 SD2 样品 2 样品 2C SD3 SD3 样品 3 样品 3D SD4 SD4E SD5 SD5F SD6 SD6G NTC NTCH附件 13-14 重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体外源性 DNA 残留量测定法（qPCR ）3）PCR 反应条件设置步 骤 温 度 时 间（min:sec）1 95 10:002 95 0:103 60 0:304 GOTO 2，39 循环4） 运行上述设置的程序。6 接受标准1）标准曲线：扩增效率（E）：90%130%；R 20.980；斜率（Slope ）：-2.7-3.6。2）样品数据：2 个复孔测定值 SQ 的 CV20%。7 结果计算与判断外源性 DNA 残留量（pg/ml）=SQ50，SQ 代表测定平均值。根据检测样品的蛋白质浓度，得出样品中每剂量所残留的外源性 DNA 量。附件 13-14 重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体外源性 DNA 残留量测定法（qPCR ）
