1、菌落总数测定卫生学意义菌落(colony)是指一个或几个相同的细菌在固体培养基上增殖而形成的肉眼可见的细菌集团。它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。菌落总数(colony count)是指食品检样经过处理，在一定的条件下(样品处理、培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧条件)培养后，所得到的每单位食品(1g，1mL，1cm2)中所含细菌菌落的总数。由于菌落总数测定是在需氧条件下进行的，而且不能区别细菌种类，因此，菌落总数又称为需氧菌数(aerobic bacterial count)或杂菌数。细菌总数：指一定数量或面积的食品样品经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数
2、。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以 1g 或 1mL 或 lcm2 样品中的细菌总数来表示。菌落总数测定的是活菌数，现在通常用 cfu/(g，mL，cm2)表示。菌落总数更具有食品卫生学意义。菌落总数主要是作为判定食品被细菌污染程度的标志，也可以应用这一方法观察食品中细菌的性质以及细菌在食品中的繁殖动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据。另外，测定食品中的菌落总数也可对这种食品的质量作出预测。如菌数在105CFU/cm2 的牛肉在 0时可保存 7d，而菌数为 103 CFU / cm2 时，在上述条件下却可保存 18d；有的食品当细菌数达到
3、106107 CFU /g 时，即能从感官上发现变质。有人认为，菌数达 106107 CFU /g 的食品即可能引起食物中毒。耐热大肠菌群的卫生学意义作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。作为粪便污染指标菌，耐热大肠菌群与大肠菌群、大肠杆菌相似，主要以其检出情况来判断食品是否受到了粪便污染。粪便是肠道排泄物，有健康者，也有肠道病患者或带菌者粪便，所以粪便中既有正常肠道菌，也可能有肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺式菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌等）和食物中毒者。因此，食品
4、既然受到粪便污染就有可能对食用者造成潜在的危害。通常情况下，耐热大肠菌与大肠菌群相比，在人和动物粪便中所占的比例较大，而且由于在自然界容易死亡等原因，耐热大肠菌群的存在可认为食品直接或间接的受到了比较近期的粪便污染。因而，耐热大肠菌群在食品中的检出，与大肠菌群相比，说明食品受到了更为不清洁的加工，肠道致病菌和食物中毒菌的可能性更大。耐热大肠菌群比大肠菌群能更贴切地反应食品受人和动物粪便污染的程度，且检测方法比大肠杆菌简单地多，而受到重视。总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏属均可作为水体是否被粪便污染的指示菌，其检出的卫生学意义从大到小依次为：大肠埃希氏属、耐热大肠菌群、总大肠菌群。其中，大肠
5、埃希氏菌属的检出表示检测物近期被粪便污染，其卫生学意义最为重要。大肠菌群的卫生学意义大肠菌群主要包括肠杆菌科中的埃希氏菌属、柠檬酸细菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。这些属的细菌均来自于人和温血动物的肠道，需氧与兼性厌氧。不形成芽胞，在 3539条件下，48h 内能发酵乳糖产酸产气，革兰氏阴性。大肠菌群中以埃希氏菌属为主，埃希氏菌属被俗称为典型大肠杆菌。大肠菌群都是直接或间接地来自人和温血动物的粪便。本群中典型大肠杆菌以外的菌属，除直接来自粪便外，也可能来自典型大肠杆菌排出体外 730 d 后在环境中的变异。所以食品中检出大肠茵群，表示食品受到人和温血动物的粪使污染，其中典型大肠杆菌为粪便近期污染
6、，其他菌属则可能为粪便的陈旧日污染。大肠菌群的食品卫生学意义是作为食品被粪便污染的指示菌，食品中粪便含量只要达到 10-3mg/kg 即可检出大肠菌群。一般认为，作为食品被粪便污染的理想指示菌应具备以下特征：仅来自于人或动物的肠道，并在肠道中占有极高的数量。在肠道以外的环境中，具有与肠道病原菌相同的对外界不良因素的抵抗力，能生存一定时间，生存时间应与肠道致病菌大致相同或稍长。培养、分离、鉴定比较容易。大肠菌群比较符合以上要求。然而由于大肠菌群在低温条件不适宜生长，特别是在冰冻条件下容易死亡，所以用大肠菌群作为冷冻食品的粪便污染指示菌并不理想。由于肠球菌对冷冻条件有强的抵抗力，因而有人主张以它作
7、为冷冻食品的粪便污染指示菌更为合适。肠道致病菌如沙门氏菌属和志贺氏菌属是引起食物中毒的重要致病菌、然而对食品经常进行逐批逐件地检验又不可能，鉴于大肠茵群与肠道致病菌来源相同，而且一般在外环境中生存时间也与主要肠道病原菌一致，所以大肠茵群的另一个重要食品卫生学意义是作为肠道病原菌污染食品的指示菌。当然食品中检出大肠菌群，只能说明有肠道病原茵存在的可能性，两者并非一定平行存在，但只要食品中检出大肠菌群，则说明有粪便污染，即使无病原菌该食品仍可被认为是不卫生的。肠球菌卫生学意义粪肠球菌为肠球菌属中最常见的即为代表种。该属通常指粪便来的可以用氮钠分离鉴定的一群革兰氏阳性球菌。由于肠球菌的菌种均含有 L
8、ancefield的 D 群抗原，亦称 D 群粪肠球菌或 D 群肠球菌。肠球菌的 DNA G+C 含量 33%-39%mol。肠球菌普遍存在于自然界，一般栖居在各种温血和冷血动物的腔肠，甚至昆虫体内，也是健康人体的上呼吸道，口腔或肠道的常居菌。本菌可以引起心内膜炎，胆囊炎，脑膜炎，尿路感染及伤口感染等多种疾病。在人类粪便中的数量仅次于大肠菌群，每克成人的粪便中约含10 8个。由于此污染指示菌比较大肠杆菌对外界环境温度适应性强、抵抗力强及耐受性强，甚至可以与多种抗生素相抵抗和生长营养要求不高，因此在自然界分布广，存活力持久。在无粪便污染的环境中较大肠菌更易发现，所以，即使检出肠球菌也没有粪便污染
9、的指示作用。此外，即使在冷冻，干燥性和经中等强度加热处理的食品中检出肠球菌也不能提示肠道致病菌的存在，因为肠球菌比沙门氏菌，致病性大肠杆菌抵抗性及存活率均高。食品微生物检验主要针对在和下可生长发育的粪肠球菌与屎肠球菌，二者在生化特性、杂交结果有明显不同。在条件下，用含叠氮钠成分的培养基检测此类指示菌是其主要特征。目前该菌多作为生活饮用水，管道水和一些水质的指示菌。卫生学家认为，肠球菌类似于大肠菌群的生态活动，但其对恶劣的外环境和冷冻条件具有较强的抵抗力，作为监测水质卫生，环境卫生质量的污染指标更具有卫生学意义。另据有关报道，大量的（ 9以上）肠球菌可以引起食物中毒，作为一个有卫生学意义的细菌（
10、该菌的污染在某些食品中也常被发现），有些国家已经制定了针对肠球菌污染限量标准，大多制定在克 5克范围内。从预防食物中毒方面，保障人民身体健康考虑，借鉴国外标准，制定适宜的污染限量指标，应尽快摆到议事日程上来。菌 种中国药典 2010 版二部试验过程中，生物样本可能是最敏感的，因为它们的活性和特性依赖于合适的试验操作和贮藏条件。实验室菌种的处理和保藏的程序应标准化，使尽可能减少菌种污染和生长特性的改变。按统一操作程序制备的菌株是微生物试验结果一致性的重要保证。药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。标准菌株的复活或培养
11、物的制备应按供应商提供的说明或按已验证的方法进行。从国内或国外菌种保藏机构获得的标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。标准储备菌株应进行纯度和特性确认。标准储备菌株保存时，可将培养物等份悬浮于抗冷冻的培养基中，并分装于小瓶中，建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存、超低温冷冻（低于-30C）等方法保存。低于-70C 或低温冷冻干燥方法可以延长菌种保存时间。标准储备菌株可用于制备每月或每周 1 次转种的工作菌株。冷冻菌种一旦解冻转种制备工作菌株后，不得重新冷冻和再次使用。工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过 5 代（从菌种保藏机构获得的标准菌株为第 0 代），以防止过度的传代增加
12、菌种变异的风险。1 代是指将活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养，任何亚培养的形式均被认为是转种或传代 1 次。必要时，实验室应对工作菌株的特性和纯度进行确认。工作菌株不可替代标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用作工作菌株。实验室必须建立和保存其所有菌种的进出、收集、贮藏、确认试验以及销毁的记录，应有菌种管理的程序文件（从标准菌株到工作菌株），该程序包括:标准菌种的申购记录；从标准菌株到工作菌株操作及记录；菌种必须定期转种传代，并做纯度、特性等实验室所需关键指标的确认，并记录；每支菌种都应注明其名称、标准号、接种日期、传代数；菌种生长的培养基和培养条件；菌种保藏的位置和条件;其他需要的
13、程序。培养基中国药典 2010 版二部培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证。1.培养基的制备培养基可按处方配制，也可使用按处方生产的符合规定的脱水培养基。在制备培养基时，应选择质量符合要求的脱水培养基或单独配方组分进行配制。脱水培养基应附有处方和使用说明，配制时应按使用说明上的要求操作以确保培养基的质量符合要求，不得使用结块或颜色发生改变的脱水培养基。脱水培养基或单独配方组分应在适当的条件下贮藏，如低温、干燥和避光，所有的容器应密封，尤其是盛放脱水培养基的容器。商品化的成品培养基除了应附有处方和使用说明外，还应注明
14、有效期、贮藏条件、适用性检査试验的质控菌和用途。为保证培养基质量的稳定可靠，各脱水培养基或各配方组分应准确称量，并要求有一定的精确度。配制培养基最常用的溶剂是纯化水，特殊情况下，可能需要用去离子水和蒸馏水。应记录各称量物的重量和水的使用量。配制培养基所用容器和配套器具应洁净，可用纯化水冲洗玻璃器皿以消除清洁剂和外来物质的残留。对热敏感的培养基如糖发酵培养基其分装容器一般应预先进行灭菌，以保证培养基的无菌性。脱水培养基应完全溶解于水中，再行分装与灭菌。配制时若需要加热助溶，应注意不要过度加热，以避免培养基颜色变深。如需要添加其他组分时，加入后应充分混匀。应按照生产商提供或使用者验证的参数进行培养
15、基的灭菌。商品化的成品培养基必须附有所用灭菌方法的资料。培养基灭菌一般采用湿热灭菌技术，特殊培养基可采用薄膜过滤除菌。培养基若采用不适当的加热和灭菌条件，有可能引起颜色变化、透明度降低、琼脂凝固力或 p H 的改变。因此，培养基应采用验证的灭菌程序灭菌，培养基灭菌方法和条件，应通过无菌性试验和促生长试验进行验证。此外，对高压灭菌器的蒸汽循环系统也要加以验证，以保证在一定装载方式下的正常热分布。温度缓慢上升的髙压灭菌器可能导致培养基的过热，过度灭菌可能会破坏绝大多数的细菌和真菌培养基促生长的质量。灭菌器中培养基的容积和装载方式也将影响加热的速度。因此，应根据灭菌培养基的特性，进行全面的灭菌程序验
16、证。应确定每批培养基灭菌后的 p H 值（冷却.至室温 2 5 测定）。若培养基处方中未列出 p H 值的范围，除非经验证表明培养基的 p H 值允许的变化范围很宽，否则，p H 值的范围不能超过规定值土 0.2。制成平板或分装于试管的培养基应进行下列检査：容器和盖子不得破裂，装量应相同，尽量避免形成气泡，固体培养基表面不得产生裂缝或涟漪，在冷藏温度下不得形成结晶，不得污染微生物等。应检查和记录批数及培养基的无菌检査。2.培养基的贮藏自配的培养基应标记名称、批号、配制日期等信息，并在已验证的条件下贮藏。商品化的成品培养基标签上应标有名称、批号、生产日期、失效期及培养基的有关特性，生产商和使用者
17、应根据培养基使用说明书上的要求进行贮藏，所采用的贮藏和运输条件应使成品培养基最低限度的失去水分并提供机械保护。培养基灭菌后若贮藏在高压灭菌器中，质量可能会受影响，一般不提倡这种存放法。琼脂培养基不得在 0或 0以下存放，因为冷冻可能破坏凝胶特性。培养基应避光保存，若要长期保存，应置于密闭容器中以防止水分流失。琼脂平板最好现配现用，如置冰箱保存，一般不超过 1 周，且应密闭包装，若延长保存期限，保存期需经验证确定。固体培养基灭菌后的再融化只允许 1 次，以避免因过度受热造成培养基质量下降或微生物污染。培养基的再融化一般采用水浴或流通蒸汽加热。若使用微波炉，应避免培养基过度受热及水分的蒸发，更要注
18、意安全。融化的培养基应置于 4550的水浴中，不得超过 8 小时。倾注培养基时，应擦干培养基容器外表面的水分，避免容器外壁的水滴进入培养基中造成污染。使用过的培养基(包括失效的培养棊)应按照国家污染废物处理相关规定进行。3.质量控制试验实验室应对试验用培养基建立质量控制程序，以确保所用培养基质量符合相关检测的需要。实验室配制或商品化的成品培养基的质量依赖于其制备过程，采用不适宜方法制备的培养基将影响微生物的生长或复苏，从而影响试验结果的可靠性。所有配制好的培养基均应进行质量控制试验。实验室配制的培养基的常规监控项目是 pH、适用性检查试验，定期的稳定性检查以确定有效期。培养基在有效期内应依据适
19、用性检査试验确定培养基质量是否符合要求。有效期的长短将取决于在一定存放条件下（包括容器特性及密封性）的培养基其组成成分的稳定性。除药典附录另有规定外，在实验室中，若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可只进行 1 次。如果培养基的制备过程未经验证，那么每一批培养基均要进行适用性检查试验，试验的菌种可根据培养基的用途从相关附录中进行选择，也可增加从生产环境及产品中常见的污染菌株。培养基的质量控制试验若不符合规定，应寻找不合格的原因，以防止问题重复出现，任何不符合要求的培养基均不能使用。用于环境监控的培养基须特别防护，最好要双层包装和终端灭菌，如果不
20、能采用终端灭菌的培养基，那么在使用前应进行 100%的预培养以防止外来的污染物带到环境中及避免出现假阳性结果。标准菌验收、制备、保藏、 传代、使用、销毁的管理1.标准菌的来源标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical culture collection ,CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0 代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3 代） 。黑曲霉的 0 代菌种为保存于含 15%甘油的 0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签 CMCC（B）代表细菌（bacteria）,CMCC(F)代
21、表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号。2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0 代原始菌种储存于20，有效期为三年。从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3 代）应检查菌种管是否完好。储存于 2 8 ，有效期为 3 个月。3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1 物品及
22、试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及 75%酒精棉球3.2 培养基改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮 .营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮 .3.3 操作步骤：a.打开洁净工作台。b.在安瓿的外表面用 75%的酒精擦拭并让其自然风干。c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂） 。d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取 0.50.8 ml
23、 到安瓿中。e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度3035，培养 1824 小时；真菌培养温度 2328，培养 35 天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至 7 天，真菌应延长培养时间至 14 天，若仍未浑浊，灭菌处理。h.黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体 12 滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置 2328培养 57 天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接
24、近菌层培养基略带黄色。确认后用含有 0.05%（ml/ml）的吐温-80 的 0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。i.取经复苏后的上述细菌菌液 8-10ml 至液体培养基中按 g 项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中加入 100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。每个菌种制备 10 支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。黑曲霉的 h 项下洗脱液按 h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液 20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入 20ml 、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备 10 支，按顺序
25、进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。j储备菌种管制备成功，储存于20，有效期为三年。3.4 菌种确认用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落。然后在 3035下培养 23 天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在2328下培养 7 天；培养后，观察其菌落形态，应符合该菌种形态特征。3.5 污染处理假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不
26、纯。将此被污染了的培养物灭菌处理。可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。并重新制备储备菌种管3.6 菌种的传代与保藏将菌种接种至一新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复溶并转至新培养基内生长，即认为已传代一次，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第 0 代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第 1 代，直到第3 代为工作菌种。菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过 5 代。菌种的传代保藏过程 3.3 项下标准菌的复苏为传第一代，复壮为第二代。 传第三代时取 1 支冻存管自然解冻，将其转接斜面菌种作为工作用菌种。此时，工作用菌种为第 3代。工作用菌种，分为两类：
27、一类用于定期传代(W3)，一类用于实验用（S3） 。定期传代用菌的传代其操作步骤如下（斜面接种法）：（1）从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约 30 分钟。 （2）将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入洁净工作台，打开紫外灯照射一小时。 （3）关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30 秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。 （4）右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少
28、量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。 （5）塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。 （6）取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。 （7）将已接种好的细菌管置 3035细菌培养箱培养 22 24h，真菌管置 2328真菌培养箱最多培养 7 天。当工作用菌种传代代数小于 5 时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种，如：（W3 ）可直接转接为（ W4） 。按上述
29、程序操作，直至（W4）转为（ W5）为止，需重新接种，旧的工作菌种进行销毁。菌种斜面的培养、保藏条件及时间 菌种 培养条件及时间 培养基 保存条件及时间大肠埃希菌 303522 24h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3 个月(CMCC(B)44102) 金黄色葡萄球菌 303522 24h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3 个月(CMCC(B)26003) 枯草芽孢杆菌 303522 24h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3 个月(CMCC(B)63501) 铜绿假单胞菌 303522 24h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3 个月(CMCC(B)10104) 乙型副伤寒沙门菌 303522
30、24h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3 个月(CMCC(B)50094) 生孢梭菌 303522 24h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3 个月(CMCC(B)64941) 白色念珠菌 2328 最多 7 天 改良马丁琼脂培养基 2 8 保存 3 个月(CMCC(F)98001) 黑曲霉 2328 最多 7 天 改良马丁琼脂培养基 2 8 保存 3 个月(CMCC(F)98003) 短小芽孢杆菌 303522 24h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3 个月 (CMCC(B)63602) 注：菌种斜面 1 次/周观察状态是否正常。3.7 菌种的使用及销毁每次进行菌种复活时，只能复活一个菌种。如
31、果要复活其他菌时，应对所用物品重新消毒灭菌。每次操作，都应进行记录。菌种管上应贴有牢固的标签。标明菌种名称、菌种代号、代次、传代人、编号和传代日期、贮存条件、有效期至等。废弃菌种及实验用品废弃物的处理：121 高压蒸汽灭菌 30 分钟。并对操作过程进行记录。军团菌军团菌，又称嗜肺军团菌，通常分布在河川、水泽中，也经常隐藏在空调制冷装置的冷却水塔中，通过水塔喷出的水雾散布在空气中，经人类呼吸道而感染。 通常，军团菌轻微患者会出现发烧和肌肉痛等症状，严重患者会出现高烧、发冷、干咳或有痰等症状，可能引发肺炎，严重的可导致呼吸衰竭和肾衰竭。军团菌肺炎不会自然康复，如果早期不重视，或治疗不规范，1-7
32、天就可死亡。如果能够早期发现，及时使用红霉素类药物，症状很快会减轻，而且愈后情况普遍良好，不会遗留后遗症。 这种致病菌最早是由于部队室内密闭作业，导致群体发生上呼吸道感染而得名。近年来，它逐渐显露出袭击都市人的迹象，过去 20 年，它在许多国家暴发，并引起了国际医学界的重视。在我国，对军团菌的防治也应引起足够的重视。 近年来，上海、北京、广州等地陆续在中央空调系统的冷却塔水中检出军团菌，检出率在 30%-84%之间，比例不低。2008 年，上海市 699 家大型公共场所集中空调卫生状况调查发现，77%以上的中央空调通风系统从未开展清洗，宾馆、饭店冷却水或冷凝水嗜肺军团菌超标率达 43.7%。
33、根据现有观察，由空调通风系统污染所引起的人体健康损害和疾病种类达几十种，主要是三类疾病：传染性疾病，比如军团菌病；过敏性疾病，包括过敏性鼻炎、哮喘、过敏性肺泡炎，以及“不良建筑综合征” 某些建筑物内由于空气污染、空气交换率低，导致身处其中者头疼、易疲劳、呼吸系统有刺激感等非特异症状。其中，军团菌病因有致病性，甚至致命性，正日益受到关注。军团菌最适合的生长温度是 36-42，当水温降至 20以下时，它将处于休眠状态。但在冬天，一旦空调启用制热模式，室内温度逐步升至 20以上后，这种致病菌会逐步“ 复活”，并恢复致病状态。这次，香港特区政府新总部大楼多处反复出现军团菌水样阳性，说明在相对静止的水环
34、境中，合适的水温（20-40） ，PH 值为 5-8.5 时，军团菌可以长期存活，并具有致病性。这个信息提示我们：冬季空调系统中军团菌依然活跃，我们切不可掉以轻心！ 军团菌的由来1976 年，美国建国 200 周年之际，美国退伍军人协会(俗称 “美国军团”)在费城的斯特拉福美景饭店召开第 85 届年会。会议举办两天后，与会人员中有180 多人相继出现高烧、头痛、干咳、呼吸困难、浑身乏力等症状，而且仅在10 天内，大会所在宾馆的职员、旅客和附近的居民中也有 36 人出现了相同症状，一时间患病人数上升至 200 多人。在他们中间，90%的人胸部 X 光片显示出肺炎迹象，最终 34 名患者不幸身亡，
35、死亡率高达 15.1%。 半年后，美国疾病预防控制中心的医学专家麦克德在饭店空调系统的冷却水中和死者的肺组织中分离出了相同的新型革兰氏阴性菌，至此这种隐藏在空调中的无形“ 杀手” 被缉拿归案。由于这种细菌是在“美国军团”中首次爆发、流行，因此后人把这种细菌命名为“军团菌” ，此病也由此获名为 “军团病”。冷冻干粉制作方法chdreamfly一、实验原理：水对各种生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥，尤其是深度干燥是微生物保藏技术中一项经常采用的手段。冷冻干燥法是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结然后在真空下通过冰的升华作用除去水分，手段比较温和，细胞受损伤程度小，存活率及保藏效果都
36、很好，且易于保存、邮寄、使用。冷冻干燥保藏菌种法可克服简单保藏方法的不足。利用有利于菌种保藏的一切因素，使微生物始终处于低温、干燥、缺氧的条件下，因而它是迄今为止最有效的菌种保藏法之一。二、实验用品：1. 菌株待保藏的各种菌种。2. 试剂2%HCl、脱脂牛奶。3.器具及其他用品安瓿管若干、标签、长滴管、脱脂棉、玻璃棉、歧管、冷冻真空装置、高频电火花器、煤气喷灯、高压蒸汽灭菌锅、移液枪、枪头（100 微升、1000 微升） 、接种环、试管、酒精灯、超净工作台、冰箱、记号笔三、实验步骤1.菌种培养将要保藏的菌种接入斜面培养，细菌的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降
37、低。一般，细菌要求 2448 小时的培养物2. 准备安瓿管安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用 2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至 pH 中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121下高压灭菌 30 分钟，备用。3.制备脱脂乳保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及 pH 值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，或使用脱脂奶粉兑脱脂牛奶，一般在 100间歇煮沸 2-3 次，每次 10-30分钟，或 112灭菌 25min 备用。4. 制菌悬液将 2ml 无菌牛奶直接加到待保藏的菌种斜面内，用接种
38、环将菌种刮下，轻轻搅拌使其均匀地悬浮在牛奶内成悬浮液。5. 分装部采用较长无菌的毛细滴管，直接将悬浮液滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每支安培管的装置约为 0.2ml。另取 4 支安瓿管分别装入 2ml、4ml 无菌蒸馏水作对照；再取两支安瓿管装入 3%的氯化钴水溶液作为指示剂。6. 预冻用程序控制温度仪进行分级降温，室温快速降至 4 摄氏度，4 摄氏度到40 摄氏度每分钟降一度，40 到60 每分降 5 摄氏度。条件不具备可用冰箱逐级降温，室温4-12-30-70也可将分装好的安瓿管在-25-40 之间的干冰酒精中进行预冻 1h。7. 真空干燥采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。将冷冻后的样品
39、安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，当温度降到-50左右时，将冻好的样品迅速放入冻干机钟罩内，启动真空泵抽气至样品干燥，时间一般为 8-20 小时。8.检验方法1、外观。样品表面出现裂痕，有脱落现象，对照管完全干燥；2、指示剂。用3%的氯化钴水溶液分装安瓿管，当溶液颜色由红色变成浅蓝色后，再抽同样长时间。9.取出样品样品抽干后先关真空泵，再关制冷机，打开进气阀使钟罩内的真空度逐渐下降，之内外气压相等后打开钟罩，取出样品。先取出几只安瓿管在桌面上敲击几下，如果样品很快疏散，说明达到要求，如果样品与内壁不脱离，则需继续干燥，样品不需再预冻。10.封管封管前将安瓿管装入歧管；真空度抽至 1.333Pa
40、后，再用煤气喷灯的细火焰（或强力酒精喷灯）熔封，封好后，要用高频火花器检查各安瓿管的真空情况。如果管内呈现灰蓝色光，证明保持着真空。检查时高频电火花器应射向安瓿管的上半部。11. 保藏做好的安瓿管应放置在低温避光处保藏（4冰箱） 。12. 活化如果要从中取出菌种恢复培养，可先用 75%酒精将管的外壁消毒，然后将安瓿管上部在火争上烧热，再滴几滴无菌水，使管子破裂。加入少许无菌水，吹打混匀使沉淀物完全溶解，转入相应培养基培养。冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。 接上面第五步，6将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体C
41、O2）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻 45 分钟，即可使悬液结冰。7真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15。安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。8抽气一般若在 30 分钟内能达到 933Pa（07mmHg ）真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度 267Pa（02mmHg） ，保持压力 68 小时即可。9封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用 L 形五通管（图-17 ）继续抽气，约 10 分钟即可达到 267Pa（02mmHg ）
42、 。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。 菌种保藏：冷冻干燥保藏法 （1）准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管，大小要求外径 6-7.5mm，长 105mm，球部直径 9-11mm，壁厚 0.6-1.2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞 1.05kg/cm2，121.3灭菌 30 分钟，备用。 （2）准备菌种，用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的
43、培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求 2448 小时的培养物；酵母需培养 3 天；形成孢子的微生物宜保存孢子；放线菌与丝状真菌则培养 7-10 天。 （3）制备菌悬液与分装以细菌斜面为例，用脱脂牛乳 2ml 左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装 0.2ml。 （4）冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。 将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体 CO2）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻 4-5 分钟，即可使悬
44、液结冰。 （5）真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15。装置仪器，安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。 抽气一般若在 30 分钟内能达到 93.3Pa（0.7mmHg ）真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度 26.7Pa（0.2mmHg） ，保持压力 6-8 小时即可。 （6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用 L形五通管继续抽气，约 10 分钟即可达到 26.7Pa（0.2mmHg ） 。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保
45、存于冰箱或室温暗处。 此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操作都比较复杂。 常用菌种保藏方法大全 基本原理 微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。 保藏方法大致可分为以下几种： 1传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养
46、、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用） ，培养后于 46冰箱内保存。 2液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用
47、其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5冷冻保藏法 可分低温冰箱（-20 -30，-50-80） 、干冰酒精快速冻结（约 -70）和液氮（-196）等保藏法。 6冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥） 。 有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 三、器材 细菌、酵母菌，放线菌和霉菌； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭
48、菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95酒精，10盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底） ，40 目与 100 目筛子，油纸，滤纸条（051 2cm ） ，干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L 形五通管，冰箱，低温冰箱（ -30） ，液氮冷冻保藏器。 四、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。 1斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至 28的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存 24 个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。 2、液体石蜡保藏法 （1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，105kg/cm2，1213灭菌 30 分钟，然后放在 40温箱
