1、第 1 章 绪论1、微生物的生物学特性体积小 面积大、吸收多 转化快、生长旺 繁殖快、适应强 易变异、种类多 分布广2、研究微生物的基本方法显微镜的使用、无菌操作技术、纯种分离技术、纯种培养技术3、微生物农药：利用微生物或其产物来防治植物病虫害和杂草危害的一类微生物制剂称为微生物农药4、原核类：三菌(细菌、放线菌、蓝细菌)三体(支原体、衣原体、立克次氏体)真核类：真菌原生动物单细胞藻类非细胞生物：病毒类病毒朊病毒5、微生物农药的特点：（1）对脊椎动物和人类无害,不污染环境；（2）对植物无毒害；（3）能保护害虫天敌；（4）昆虫不易产生抗药性；（5）自然传播感染能力:有些昆虫病原微生物,可在昆虫群
2、落中自然传播感染成流行病；（6）容易进行大量生产。6、法国的巴斯德（L.Pasteur，18221895）和德国的科赫（R.Koch，18431910） ，他们可分别称为微生物学的奠基人和细菌学的奠基人。第 2 章 环境中的微生物1、 细菌的形态2、革兰氏染色的主要步骤及反应原理（1）从细胞壁的结构及其化学组成成分的角度来解释：革兰氏染色是基于细菌细胞壁特殊化学组分基础上的一种物理原因。通过初染和媒染操作后，在细菌细胞的膜或原生质体上染上了不溶于水的结晶紫与碘的大分子复合物。革兰氏阳性细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧密，故在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩，再加上
3、它基本上不含类脂，故乙醇处理不能在壁上溶出缝隙，因此，结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在其细胞壁内，使其呈现紫色。反之，革兰氏阴性细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，故遇乙醇后，肽聚糖网孔不易收缩，加上它的类脂含量高，所以当乙醇把类脂溶解后，在细胞壁上就会出现较大的缝隙，这样，结晶紫与碘的复合物就极易被溶出细胞壁，因此，通过乙醇脱色后，细胞又呈无色。这时，再经沙黄等红色染料进行复染，就使革兰氏阴性细菌获得了一层新的颜色红色，而革兰氏阳性菌则仍呈紫色（实为紫中带红） 。 （2）从细菌等电点的角度来解释：已知革兰氏阳性菌的等电点为 pH2-3，革兰氏阴性细菌的等电点为 pH4-5，可见，革兰氏阳性菌的
4、等电点比革兰氏阴性菌的等电点低，说明革兰氏阳性菌带的负电荷比革兰氏阴性菌多。当革兰氏阳性菌菌所带的负电荷与结晶紫结合时其结合力大；用碘-碘化钾媒染后，G+与 G-者的等电点均得到降低，但革兰氏阳性菌的等电点降低得多，故与结晶紫结合得更加牢固，对乙醇脱色的抵抗力更强。结晶紫、碘-碘化钾复合物不被乙醇提取，菌体呈现紫色。而革兰氏阴性菌与结晶紫的结合力弱，结晶紫与碘的复合物很容易被乙醇捕风捕风抽提而使菌体呈现无色，复染后呈现红色。 3、原生质体(protoplast)指在人工条件下用溶菌酶除尽原有细胞壁或用青霉素抑制细胞壁的合成，而形成的仅由细胞膜包裹着的圆球形、对渗透压变化敏感的细胞，常由革兰氏阳
5、性菌形成4、 球状体或原生质球(sphaeroplast)指在人工条件下用溶菌酶除尽原有细胞壁或用青霉素抑制细胞壁的合成，而形成的残留部分细胞壁的原生质体，常由革兰氏阴性细菌形成5、间体 是一种由细胞质膜内褶而形成的囊状结构，其中充满着层状或管状的泡囊，常常同核质相联系，位于细胞分裂处。功能：可能参与呼吸作用、同 DNA 的复制和细胞的分裂有关。 6、载色体 是一些不放氧型光合细菌细胞质膜多次内陷折叠而形成的片层状、微管状或囊状的结构。载色体含有菌绿素和类胡萝卜素等光合色素及进行磷酸化所需的酶类和电子 传递体是进行光合作用的部位7、类囊体 是蓝细菌细胞中存在的由单位膜组成的囊状体，其上含有叶绿
6、素、藻胆色素等光合色素和有关酶类，是光合作用的场所8、羧酶体是自养细菌所特有的内膜结构可能是固定 CO2的场所。羧酶体中含有自养生物所特有的 5-磷酸核酮糖激酶和 1，5-二磷酸核酮糖羧化酶，这两种酶是卡尔文循环中固定 CO2 的关键性酶类，通过卡尔文循环，使自养菌与异养菌一样含有了磷酸己糖。一些光合细菌，如蓝细菌以及化能自养菌如硝化杆菌科细胞中均具羧酶体。9、核区生理功能:a、是储存和发出遗传信息的物质基础 b、在细胞分裂过程中，DNA 复制又是遗传信息传给后代的物质基础。 10、质粒是存在于细菌染色体以外的遗传物质，多由共价闭合环状双螺旋 DNA 分子组成，分散在细胞质中独立复制或整合到细
7、菌染色体上。质粒的特点: （1）可以在细胞质中独立于染色体之外（即以游离状态）存在，也可以插入到染色体上以附加体的形式存在；（2）在细胞分裂时，可以不依赖于细菌染色体而独立进行自我复制，也可以插入到细菌染色体中与染色体一道进行复制；（3）质粒可以通过转化、转导、或接合作用而由一个细胞转移到另一个细胞，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；但不能自发产生 （4）质粒对于细胞生存并不是必要的。（5）主要控制一些次生代谢产物的生成，如：维生素、色素、抗生素等。 11、核糖体: 是蛋白质合成的场所12、芽孢:有些细菌在一定的生活环境里或生长到一定的阶段，在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、折光性
8、极强、抗逆性极强的休眠体，称为芽孢13、伴孢晶体：在形成芽孢的同时，在芽孢旁形成的一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体 内毒素，称为伴孢晶体。如苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis,BT 杀虫剂）特点：不溶于水，对蛋白酶类不敏感；易溶于碱性溶剂14、糖被：某些细菌在一定营养条件下向胞外分泌出厚度不定、包被于细胞壁外的胶状物质，此称为糖被（1）荚膜：某些细菌生活在一定的营养条件下由细胞内向细胞壁表面分泌的厚度200nm的透明、粘液状的物质，使细菌与外界环境有明显的边缘，称。如巨大芽孢杆菌。（2）微荚膜： 200nm，光学显微镜不能看见，但可采用血清学方法证明其存在 ，易被胰
9、蛋白质酶消化 （3）粘液层：有些细菌分泌多糖粘性物质，疏松地附着在细胞壁的表面，可向四周扩散并且容易消失，与外界环境没有明显的边缘，这个结构称为 （4）菌胶团：在水处理工程领域内，则将所有具有荚膜或粘液的絮凝性细菌互相絮凝聚集成的菌胶团块都称为菌胶团。15、鞭毛：是细菌的运动器官16、菌毛：使菌体附着于物体表面的功能17、菌落（colony） 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度形成的肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌苔（bacterial lawn） 是指在固体培养基上由许多细菌或孢子生长、繁殖形成的肉眼可见、相互连成一片的大量菌落群体。18、液体培养特
10、征：反映微生物与氧气的关系19、半固体培养基：含 0.35-0.4%琼脂；穿刺接种法用途：观察细菌是否扩散生长，判断细菌运动性及是否含鞭毛。20、放线菌：细长分枝的原核单细胞生物21、菌落特征 （与细菌特征正好相反）表面常呈粉末状或皱褶状(？) ，有的则呈紧密干硬的圆形，有些为糊状。颜色各异，正反不同(？) ，质地紧密，菌落不易用接种环挑起(？)，较小 。第 3 章 微生物的营养1、传统上根据功能不同对营养物归类：水、无机盐和碳源、氮源、能源、生长因子等2、碳源：凡可被用来构成细胞物质或代谢产物中碳素来源的营养物质。功能：提供合成细胞物质及代谢物的原料;并为整个生理活动提供所需要能源（异养微生
11、物） 。种类: 3、光能无机营养型：依靠体内的光合色素,利用光作为能源,以 H2O 和 H2S 作供氢体,CO2为碳源合成有机物,构成自身细胞物质的微生物 化能无机营养型：以 CO2 作为唯一碳源物质,以 S,H2S,H2,NH3,Fe 等无机物氧化释放的化学能为能量合成有机物质的微生物化能异养型微生物：至少需提供一种大量有机物才能满足其正常要求的微生物，即其碳源必须是有机物，氢供体是有机物，能源则可以利用氧化有机物而获得。光能异养型微生物：至少需提供一种大量有机物才能满足其正常要求的微生物，即其碳源必须是有机物，氢供体是有机物，能源则可以利用光能而获得。4、生长因子:是一类对微生物正常生活所
12、不可缺少而需要量又不大，但微生物自身不能用简单的碳源或氮源合成，或合成量不足以满足机体生长需要的有机营养物质。不同微生物需求的生长因子的种类和数量不同。5、培养基：应科研或生产的需要，由人工配制的、适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质（混合养料）6、 （1）化能自养菌氧化硫杆菌的培养基粉末状硫 10g KH2PO4 4g MgSO4 0.5g CaCl2 0.5g (NH4)2SO4 0.4g FeSO4 0.01g 水 1000mL其中各组分作用是什么？碳源是什么？（2）异养细菌的培养基中至少有一种有机物，实验室中通常是葡萄糖 如一种大肠杆菌培养基：葡萄糖 0.5g K2HPO4
13、 1g MgSO4 0.2g NaCl 5g NH4H2PO4 0.4g 水 1000mL其中各组分作用是什么？碳源是什么？7、培养基的配制原则目的明确；营养协调;理化适宜；经济节约。8、根据培养基的成分和物理状态分：9、根据培养基用途：基础型、选择型、鉴别型、加富型 选择性培养基：在培养基中加入某种物质，以杀死或抑制不需要的微生物的生长，而促进目的微生物生长的培养基。 加富培养基：在培养基中加入某种物质，以促进目的微生物生长成为优势菌的培养基。 鉴别培养基：在培养基中加入某种试剂后，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物的培养基。10、营养物质的运输方式：单纯
14、扩散、促进扩散、主动运输、基团转位单纯扩散（simplediffusion）又称被动运送（passivetransport） 。细胞膜这层疏水性屏障可以通过物理扩散方式让许多小分子、非电离分子尤其是亲脂性的分子被动地通过，这就是单纯扩散。这类物质的种类不多，主要是氧、二氧化碳、乙醇和某些氨基酸分子，还没有发现过糖分子可通过单纯扩散而进入细胞的例子。单纯扩散不是细胞获取营养物质的主要方式，因为细胞既不能通过它来选择必需的营养成分，也不能将稀溶液中的溶质分子进行逆浓度梯度运送，以满足细胞的需要。促进扩散（facilitateddiffusion）与单纯扩散的一个主要差别，是在溶质的运送过程中，必须
15、借助于膜上底物特异性载体蛋白（carrierprotein）的参与。由于参与的方式不同，载体蛋白还有许多其他名称，例如透性酶（permease） 、移位酶（translocase）或移位蛋白（translocatorprotein）等。这种载体蛋白运送溶质的机制可能是由于其构象的改变：在膜的外侧时，它能与溶质分子结合，而在膜的内侧则可释放此溶质，且不必提供任何能量。这类载体蛋白具有酶的性质，而且必须是诱导产生的。促进扩散只能把环境中浓度较高的分子加速扩散到细胞内，直至膜两侧的溶质浓度相等时为止，而决不能引起溶质的逆浓度梯度运送。因此，它只对生长在高营养物浓度下的微生物发挥作用。主动运送（act
16、ivetransport）是微生物吸收营养物质的主要机制。其特点是它的特异性载体蛋白在运送溶质的过程中，需要提供能量（质子势、ATP 等）而发生构象变化；同时，它可逆浓度梯度进行运送，从而使生活在低营养环境下的微生物能获得浓缩形式的营养物。由主动运送的营养物主要有无机离子、有机离子和一些糖类（例如乳糖、蜜二糖或葡萄糖）等。基团移位（grouptranslocation）也是一种既需特异性载体蛋白又须耗能的运送方式，但溶质在运送前后会发生分子结构的变化，因而不同于上述的主动运送。基团移位在 Escherichiacoli（大肠杆菌）和 Staphylococcusaureus（金黄色葡萄球菌）中
17、研究得较多。有关这四种运送方式的细节和形象化的解释可见图 5-1 和表 5-14。基团移位主要用于运送葡萄糖、果糖、甘露糖、核苷酸、丁酸和腺嘌呤等物质。以葡萄糖为例，其特点是每输入一个葡萄糖分子，就要消耗一个 ATP 的能量。运送的机制是依靠磷酸转移酶系统，即磷酸烯醇式丙酮酸-己糖磷酸转移酶系统。其运送的步骤为：（1）热稳载体蛋白（HPr，heat-stablecarrierprotein）的激活细胞内高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的磷酸基团把 HPr 激活。HPr 是一种低分子量的可溶性蛋白质，结合在细胞膜上，具有高能磷酸载体的作用。酶 1 是一种可溶性的细胞质蛋白。（2）糖被磷酸化后
18、运入膜内膜外环境中的糖先与外膜表面的酶 2 结合，再被转运到内膜表面。这时，糖被 P-HPr 上的磷酸激活，通过酶 2 的作用把糖-磷酸释放到细胞内。酶 2 是一种结合于细胞膜上的蛋白，它对底物具有特异性选择作用，因此细胞膜上可诱导出一系列与底物分子相应的酶 2。第 4 章 微生物的代谢1、代谢：细胞内发生的各种化学反应总称，主要由分解代谢和合成代谢组成。 分解代谢：细胞将大分子物质降解成小分子物质，并产生简单分子、腺苷三磷酸（ATP）形式的能量和还原力（一般表示为H ） 。 合成代谢:细胞利用简单小分子物质合成复杂大分子的过程，需消耗能量。合成代谢所利用的小分子物质来源于分解代谢过程中产生的
19、中间产物或环境中的小分子营养物质。生物氧化：是物质在生物体内经过一系列连续的氧化还原反应，逐步分解并释放能量的过程，又称为分解代谢，是一个产能代谢过程。根据氧化还原方式中电子受体的不同可分为发酵和呼吸两种类型；发酵和呼吸；呼吸可分为有氧呼吸和无氧呼吸两种方式发酵：微生物细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物本身未完全氧化的某种中间产物，同时释放能量并产生各种不同的代谢产物。呼吸作用：微生物在降解底物的过程中，将释放出的电子交给 NADP、FAD 或 FMN 等电子载体，再经电子传递系统传给外源受体，从而生成水或其他还原型产物并释放出能量的过程，称为呼吸作用。以分子氧作为最终电子受体的称为有氧呼
20、吸；以氧化型化合物作为最终电子受体的称为无氧呼吸。微生物体内葡萄糖被降解成丙酮酸的过程称为糖酵解，主要分为四种途径： 糖酵解途径/己糖二磷酸途径（EMP 途径） 已糖-磷酸途径/戊糖磷酸途径（HMP 途径） 2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸裂解途径（ED 途径） 磷酸解酮酶途径（PK 途径/HK 途径）HMP 途径的微生物生命中的作用 为核苷酸和核酸的生物合成提供戊糖-磷酸； 产生大量的 NADPH 形式的还原剂，它不仅为合成脂肪酸、固醇等重要细胞物质之需，而且可通过呼吸链产生大量能量，这些都是 EMP 途径和三羧酸循环所无法完成的； 如果微生物对戊糖的需要超过 HMP 途径的正常供应量时，可
21、通过 EMP 途径与本途径在果糖-1,6-二磷酸和甘油醛-3-磷酸处的连接来加以调剂 反应中的赤藓糖-4-磷酸可用于合成芳香氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸。 在反应中存在 C3-C7 的各种糖，使具有 HMP 途径的微生物的碳源利用范围更广； 本途径产生的重要发酵产物很多，如核苷酸、若干氨基酸、辅酶和乳酸（异型乳酸发酵）等。大多数好氧和兼性厌氧微生物都有 HMP 途径；同一微生物往往同时存在 EMP 和 HMP 途径；2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸（KDPG）裂解途径。ED 途径在革兰氏阴性细菌中分布较广，特别是假单孢菌和固氮菌的某些菌株较多存在。ED 途径是少数 EMP 途径不
22、完整的细菌如一些假单孢菌和一些发酵单孢菌等所特有的利用葡萄糖的替代途径其特点是：葡萄糖只经过 4 步反应即可快速获得由 EMP 途径须经 10 步才能获得的丙酮酸。磷酸解酮酶途径是明串珠菌在进行异型乳酸发酵过程中分解已糖和戊糖的途径。该途径的特征性酶是磷酸解酮酶，根据解酮酶的不同，把具有磷酸戊糖解酮酶的称为 PK 途径，把具有磷酸已糖解酮酶的叫 HK 途径。2、细菌酒精发酵：经 ED 途径发酵产生乙醇的过程与传统上的由酵母菌通过 EMP 途径生成乙醇不同，故称细菌酒精发酵 细菌酒精发酵比起传统的酵母发酵有许多优点： 1 代谢速率高；2 产物转化率高；3 菌体生成少；4 代谢副产物少；5 发酵温
23、度较高；6 不必定期供氧等； 其缺点主要是其生长 pH 为 5，较易染菌（而酵母菌为 3） 。其次是细菌耐乙醇力较酵母菌为低。3、不同微生物进行乙醇发酵时，其发酵途径也不相同：酵母的“同型酒精发酵”：由酿酒酵母等经 EMP 途径进行细菌的“同型酒精发酵”：由运动发酵单孢菌等经 ED 途径进行细菌的“异型酒精发酵”：由 Leuconostoc mesenteroides 等经 HMP 途径进行4、乳酸细菌: 许多细菌能利用葡萄糖产生乳酸，这类细菌称为。 根据产物的不同，乳酸发酵有三种类型：同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和双歧发酵。 同型乳酸发酵：葡萄糖经 EMP 途径降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶
24、的作用下被NADH 还原为乳酸，由于终产物为 2 分子乳酸，故称为同型乳酸发酵； 异型乳酸发酵：葡萄糖首先经 PK 途径分解，发酵终产物除乳酸外还有一部分乙醇 或乙酸和 CO2 等多种产物。 双歧发酵：两歧双歧杆菌发酵葡萄糖产生乳酸的一条途径。此反应中有两种磷酸酮糖酶参与反应，即果糖-6-磷酸磷酸酮糖酶和木酮糖-5-磷酸磷酸酮糖酶分别催化果糖-6-磷酸和木酮糖-5-磷酸裂解产生乙酰磷酸和丁糖-4-磷酸及甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸。5、混合酸发酵，又称甲酸发酵，是大多数肠杆菌的特征大肠杆菌，HCOOH CO2H2（甲酸氢解酶催化） ，甲酸氢解酶在酸性条件下（pH6.2 以下）形成有些肠道菌如志贺
25、氏菌不具有此酶，故在菌种鉴定的生化试验中，它们发酵糖产酸不产气6、丁二醇发酵 V.P 试验是在丁二醇发酵液中加入精氨酸，显红色，称为 V.P 反应。大肠杆菌 V.P 反应为阴性，而产气气杆菌的 V.P 反应为阳性V.P 试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。丙酮酸缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即 V.P 试验反应阳性，不产生红色化合物的为 V.P 试验反映阴性。 甲基红反应：大肠杆菌发酵葡萄糖，由于产酸结果可使培养液 pH 下降至 pH4.2 或更低；甲基红指示
26、剂 pH6.3 呈橙黄色，pH4.2 呈红色产气气杆菌发酵葡萄糖，由于将 2 分子丙酮酸转化为一分子中性的乙酰甲基甲醇，所以培养液的 pH 值比大肠杆菌的高（pH6.3） ；如在这两种菌的培养液中加入甲基红，则产气气杆菌的呈橙黄色，大肠杆菌的呈红色，前者为甲基红反应阴性，后者为甲基红反应阳性。7、在德氏乳杆菌中由丙酮酸产生： 许多原核厌氧微生物中由乙酰辅酶 A 产生； 在明膜明串杆菌和两歧双歧杆菌中由木酮糖-5-磷酸产生； 在两歧双歧杆菌中还可由果糖-6-磷酸产生；乙酰磷酸经乙酸激酶的催化，就可完成底物水平磷酸化产能：乙酰磷酸ADP乙酸ATP 酵母的一型发酵：在酵母菌的乙醇发酵中，酵母菌可将葡
27、萄糖经 EMP 途径降解为两分子丙酮酸，然后丙酮酸脱羧生成乙醛，乙醛作为氢受体使 NAD再生，发酵终产物为乙醇。酵母的二型发酵：当环境存在亚硫酸氢钠时，它可与乙醛反应生成难溶的磺化羟基乙醛。由于乙醛和亚硫酸盐结合而不能作为 NADH 的受氢体，所以不能形成乙醇，迫使磷酸二羟丙酮代替乙醛作为受氢体，生成 -磷酸甘油。-磷酸甘油进一步水解脱磷酸而生成甘油。酵母的三型发酵：在弱碱性条件下（pH7.6） ，乙醛因得不到足够的氢而积累，两个乙醛分子间会发生歧化反应，一分子乙醛作为氧化剂被还原成乙醇，另一个则作为还原剂被氧化成乙酸，氢受体则由磷酸二羟丙酮担任，发酵终产物为甘油、乙醇和乙酸。这种发酵不能产生
28、能量，只能在非生长的情况下才进行。8、反硝化作用：指反硝化细菌（兼性厌氧微生物）以硝酸盐作为最终电子受体，使 NO3-还原成 NO2-、N2O、N2 等的过程（通常称脱 N 作用）对农业和环境影响及控制措施： 不利影响：N 素损失，污染环境； 控制措施：保证土壤良好通气条件；有机物施用均匀适量；避免土壤反复干湿交替，因为有机质氨化作用产氨，在干、氧气充分条件下，氨经硝化作用转变成 NO3- ，若立即淹水，在厌氧条件下进行反硝化作用；水田应施 NH4+N，不利施 NO3-N； NH4+ N 应深施，可同时伴施抑硝剂。9、反硫化作用：土壤淹水、河流、湖泊等水体处于缺氧状态时，硫酸盐、亚硫酸盐、硫代
29、硫酸盐和次硫酸盐在微生物的还原作用下形成硫化氢，这种作用称为硫酸盐还原作用 或反硫化作用。对农业和环境的影响： （1）有利：水域中，使 S 素以 H2S 的形式返回大气，避免水域中的 S 素大量集聚。 （2）不利：导致土壤硫素损失；H2S 毒害；金属管道的腐蚀；饮用水的污染。 若水稻土中 S 素过多，在氧化层，易造成酸害；还原层易造成 H2S 毒害；即双重毒害。 有机质含量高且局部缺氧旱田中，反硫化细菌生长旺，使有蛋白质分解时产生H2S，土壤中硫酸盐经反硫化作用也易产生 H2S 。同时由于土壤中缺氧，硫化作用停止或微弱，以致 H2S 累积太多，毒害作物根系。水稻田中施有机肥料不均匀，常引起 H
30、2S 毒害而发生水稻秧苗烂根现象。10、氨的氧化（硝化作用） 硝化细菌将氨氧化，释放能量同化 CO2 合成细胞物质。 硝化细菌可分为两个亚群：亚硝酸细菌和硝酸细菌。对农业和环境的影响：11、硫的氧化（硫化作用） 硫化细菌能利用一种或多种还原态或部分还原态硫化合物(包括硫化物、元素硫、硫代硫酸盐、多硫酸盐和亚硫酸盐)作能源，最后生成 H2SO4 的过程。硫化作用对农业和环境的影响 产生 SO42-，作为植物直接吸收 S 素物质；解除 H2S 毒害和除臭；使土壤的微域环境酸化，促进难溶 S 素的有效化，但同时可能导致作物酸害。12、指出硝化细菌培养基的 C 源、N 源、能源分别是什么？硝化细菌培养
31、基：(NH4)2SO40.5g、NaCl0.3g、FeSO4.7H2O0.03g、K2HPO41g、MgSO4.7H2O0.3g、CaCl27.5g、蒸馏水 1000ml。13、指出反硝化细菌培养基的 C 源、N 源、能源分别是什么？反硝化细菌培养基：KNO32.0g、MgSO4.7H2O0.2g、K2HPO40.5g、酒石酸钾钠 20g、蒸馏水 1000ml、pH7.2。1、指出硝化细菌培养基的 C 源、N 源、能源分别是什么？硝化细菌培养基：(NH4)2SO40.5g、NaCl0.3g、FeSO4.7H2O0.03g、K2HPO41g、MgSO4.7H2O0.3g、CaCl27.5g、蒸馏
32、水 1000ml。2、指出反硝化细菌培养基的 C 源、N 源、能源分别是什么？反硝化细菌培养基：KNO32.0g、MgSO4.7H2O0.2g、K2HPO40.5g、酒石酸钾钠 20g、蒸馏水 1000ml、pH7.2。第 5 章 微生物的生长和控制1、细菌细胞数目的测定方法：1、总菌数 2、活菌数（1） 显微镜直接计数法 这种方法只适用于细菌等单细胞的微生物类群。测定是需用细菌计数器（适用于细菌）或血球计数板（适用于真菌孢子、酵母菌等）在普通光学或相差显微镜下直接观察并记录一定体积中的平均细胞数。换算出供测的样品的细胞数。用于直接计数法的菌悬液浓度不宜过高或过低。一般细菌数应控制在 10 个
33、/ml，酵母菌和真菌孢子应为 10 10 个/ml。活跃运动的细菌应先将其用甲醛杀死或适度加热以使其停止运动。这种方法的优点是快捷简便、容易操作；缺点是不能区分活细胞以及形状与微生物相似的颗粒性杂质。（2） 比浊法 这是测定悬液中细胞总数的快速方法。原理是悬液中细胞数量越多，浊度越大，在一定浓度范围内，悬液中的细菌细胞浓度与光密度（OD 值）成正比，与透光度成反比。因此，可使用光电比色计测定。需要预先测定光密度与细菌数目的关系曲线，然后根据此曲线查得待测样品中细菌数。由于细菌细胞浓度仅在一定的范围内与光密度成直线关系，因此，要调节好待测菌悬液细胞浓度。培养液的颜色也不宜过深，颗粒性杂质也会干扰
34、测定结果。本法常用于跟踪观察培养过程中细菌数目的消长情况。如细菌生长曲线的测定和工业生产上的发酵罐中的细菌生长情况等。2、活细菌数量的测定是测定具有繁殖能力的细菌数量的方法。在大多数情况下，人们更关心的是计算活菌数。（1） 稀释平皿测数法 理论上可以认为在高浓度的稀释条件下，微生物细胞充分分散成单个细胞存在的形式，每个活的单细胞均能繁殖形成一个菌落，因此可以用平皿培养的方法使每一个活细胞生长并形成一个单独的菌落，通过统计长出的菌落数来推算待测样品的活菌数。具体做法像稀释平皿分离法一样，先将待测样品作一系列倍比稀释，将定量的稀释液接种到琼脂培养基上作平皿培养，根据平皿上出现的菌落数，便可以推算出
35、待测样品中的活菌数。本方法是迄今为止仍广泛采用的主要活菌计数方法之一。缺点是由于供实验用的培养基和实验条件的限制，在混合微生物样品中并非所有细菌都能形成肉眼可见的菌落。而且在实际操作中难以做到使所有细胞完全分开，即不能保证每个菌落都是由单个细胞分裂而来，所以现在多用菌落形成单位来表示样品中活细菌数。具体操作可采用倾注平板法或涂布平板法来进行测数。（2） 最大概率法 将待测样品在定量的培养液中作一系列稀释培养。在一定稀释度数以前的培养液中出现细菌生长，而在这个稀释度后的培养液中不出现细菌生长。将最后的三级有菌生长的稀释度称为临界级数，从重复的三个临界级数求得最大概率数（MPN），可以计算出样品单
36、位体积中细菌的近似值。以 5 次重复为例，某一细菌在稀释法中的生长情况如下：最大概率法特别适合于含菌量少的样品或一些在固体培养基上不容易生长的细菌样品的测数，如测定土壤微生物中的特定生理类群（如氨化、硝化、纤维分解、自生固氮、根瘤菌、硫化和反硫化细菌等）的数量和检测污水、牛奶及其食品中特殊微生物类群的细菌数量。其缺点是只能进行特殊生理类群的测定，结果也比较粗放。（3） 浓缩法（滤膜法）对于测定象空气、水等体积大而且含菌浓度较低的样品中的活菌数，应将待测样品通过微孔薄膜（硝酸纤维素薄膜）过滤富集，再与膜一起防到合适的培养基或浸有培养液的支持物表面上培养，最后可根据菌落数推算出样品中含菌数。2、活
37、细菌重量变化曲线细菌内源呼吸增长率上升阶段 及细菌大量死亡阶段 mg/L活细菌重量t0 时间t增长率下降阶段一、 细菌纯培养的群体生长规律细菌的生长曲线将少量单细胞纯培养接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养，定时取样测定细菌含量，可以看到以下现象：开始有一短暂时间，细菌数量并不增加，随之细菌数目增加很快，继而细菌数又趋稳定，最后逐渐下降。如果以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速度为纵坐标作图，可以得到曲线，称为细菌的生长曲线。对单细胞微生物而言，虽然生长和繁殖是两个不同的概念，但由于在测定方法上，多以细菌数增加(即繁殖)作为生长指标，它们的繁殖也可视为群体的生长，所以
38、，繁新的适宜的环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化。根据细菌生长繁殖速率的不同，可将生长曲线大致分为延迟期、对数期、调整期或滞留适应期。（一）延迟期当细菌被接种到新鲜培养基中，开始一段时间内，通常不立即进行细胞分裂、增殖，生长速率近于零，细胞数目几乎保持不变，甚至稍有减少，这段时间被称为迟缓期。特征迟缓期是细胞分裂启动之前的恢复或调整期。而不是生长的休眠或停留期。迟缓期细胞的主要特征是代谢活跃，体积增大，从介质中快速吸收各种营养物质，大量合成细胞分裂所需的酶类，ATP 和其他细胞成分，为细胞分裂作准备。由于细胞重量持续增大，因此重量图中没有类似的迟缓期。产生原因迟缓期可以很长，也可以很短
39、甚至不明显。迟缓期的形成有多种原因。但都与接种细菌的状态有关。接种细菌时的状态大体有以下几种情况生 长 速 度 细 菌 缓 数 慢 目 期 的 对 稳 定 期 对 数 衰 老 期 数 期 值 0 t 时 间 .接种生长对数期的细菌n 处于生长对数期的培养物被接种到与原先同样的生长条件和同样培养基中后，几乎能够以同样速率进行对数生长，迟缓期不明显；. 接种生长稳定期或衰亡期的细菌如果被接种的是处于生长稳定期或衰亡期的培养物，即使此时培养物中所有细胞都是活的，迟缓期也会发生。这是因为稳定期细胞生理上已经衰老，其合成机制处于损伤状态，基本耗尽了各种辅酶或其他细胞成分，因而需要一定时间进行生理修复和物
40、质的再合成。.接种受损细胞n 如果接种菌是因热、辐射或有毒化学物质处理而受到损伤的细菌，迟缓期也会发生，因为细胞需要时间修复这种损伤。.接种富集培养基的细菌n 当细菌被从营养丰富的培养基转移到营养贫乏培养基后，为了合成新培养基中所缺乏的某种营养物质以满足自身生长，结果也导致迟缓期的出现。此外，菌种的遗传特性和接种体积的大小也会影响迟缓期的长短。缩短迟缓期的方法（1）采用最适种龄(处于对数期的菌种)（2）增大接种量，一般来说，接种量大，则迟缓期短，反之则长。（3）接种到营养丰富的天然培养基中的微生物，要比接种到营养单调的组合培养基中的迟缓期短。所以，一般要求发酵培养基的成分与种子培养基的成分尽量
41、接近，且应适当丰富些。（二）对数期一旦细菌细胞的生理修复或调整完成，迟缓期即告结束，细胞开始进入快速分裂阶段。这一时期细胞数目的增加以 2n 级数进行，细菌的数目 X 的增长率只与细菌的初始数量有关。特点菌体高速生长，生长速率常数最大，增代时间和原生质增倍的时间最短;生长繁殖速度易受培养温度的影响，应该尽量接近最适生长温度;处于该阶段前期的细胞对理化因素影响仍很敏感;d)菌体大小、形态、生理特征比较一致，大多是单个存在。细菌代时的计算（三）稳定期如果对数期的细胞分裂不受节制的连续进行，理论上一个代时为 20 min。重 1012g的细菌，经过 48h 的对数生长之后，其群体重量可达到地球重量的
42、 4000 倍。然而由于营养物的有限，这种情况不会发生。在一个封闭的系统中，细菌的对数生长只能维持一个短暂的时期，最终生长将会降低，代时延长，细胞活力减退。此时新生的细胞数目与死亡的细胞数目相等，总菌数达到最大值，活菌数保持恒定。图中的生长速率为一定值，故将其称为稳定期。相当于重量生长曲线中的生长率下降阶段。特征：1、稳定期细胞的特征是从生理上的年轻转化为衰老，表现为细菌的代谢活力钝化，细胞含有较少的核糖体，RNA 和蛋白质合成缓慢，mRNA 的水平低下，因此细胞的生长变得不平衡，细胞的形状有的也发生改变。因不能维持细胞壁的合成与修复，细胞的染色特点也发生变化，如 G+转变为 G-。2、但此时
43、细胞的很多功能，如能量代谢和某些生物合成过程还在继续进行，生物化工中作为产品的某些细菌代谢产物如抗生素和某些酶就是在稳定期，特别是在对数期与稳定期转换阶段所产生的。某些细菌的芽孢产生也发生在稳定期。出现原因：由于营养物质消耗，代谢产物积累和 pH 等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数)。（四）死亡期如果处于稳定期的细菌继续培养，细胞的死亡率将逐渐增加，最终群体中活的细胞数目将以对数速率急剧下降，此阶段就被称为死亡期。特征1、死亡期细胞的总数虽然镜检直接计数可能会保持不变，但间接菌落计数检测到的活细胞数目却在减少，同时伴随着细胞的裂解或自溶
44、可释放出一些代谢产物，如氨基酸、转化酶、外肤酶或抗生素等。个体细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有的细胞内含很多的空泡，G+染色反应转变成 G染色反应。2、死亡期的长短与对数生长期一样在不同微生物中变化是很大的，主要与菌种的遗传特性有关。3、有些细菌的培养物经历所有的各个生长时期，几天以后死亡；另一些细菌培养物在几个月甚至几年以后仍然含有一些活的细菌。产芽孢的细菌其芽孢比代谢活跃的营养细胞更易于幸存下来。4、通过补充营养和能源，以及中和环境毒性，可以减缓死亡期的细胞死亡速率，延长细菌培养物的存活时间。出现原因：营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体
45、呈现出负增长。（二）同步培养1、同步分裂培养就是通过一定的手段，使培养物中所有的细胞处于同一生长阶段，使群体与个体的行为保持一致。同步分裂培养的生长曲线呈现“梯形”状，见图 3.1.9。这种培养方式主要用在实验室中进行微生物细胞的生理生化研究。2、使细胞分裂同步的手段主要有两种：诱导法和选择法。1、诱导法控制培养的物化条件（如温度、营养物），诱使细胞同步生长的方法称为诱导法。如果让菌体在低于或高于最适生长温度的环境下培养一段时间，这些细胞缓慢生长，但不发生分裂，然后，再将培养温度恢复到最适生长温度，这时，大多数细胞就会同时进行分裂。例如将鼠伤寒沙门氏杆菌置 2528 分钟，378 分钟，重复几
46、次，就能获得 37下同步生长的培养物。2、选择法选择法是通过差速离心或过滤等手段，将处于不同生长阶段的细胞分开，从而实现同步培养。选择法的优点是它不会影响菌体的正常代谢，获得的菌体活力正常。但是，这种方法只适用于不同生长阶段的细胞大小和比重有明显差异的微生物种类。选择法中有一种较巧妙的操作方法硝酸纤维素薄膜法，其大致过程如图所示：（1）将菌液通过装有硝酸纤维素滤膜的过滤器，由于细菌与滤膜带有不同的电荷，所以处于不同生长阶段的细菌均附着在膜上；(2)将膜翻转，再用新鲜的培养液滤过培养；(3)附着在膜上的细菌开始分裂，分裂的子细胞不能与薄膜直接接触，由于菌体自身重量，加上它附带的培养液的重量，使菌
47、体下落到收集器内；(4)收集器在短时间内获得的细菌都是处于同一分裂阶段的新细胞，用这些细胞接种培养，便能得到同步培养物。1 从混合在一起的微生物群体中得到特定的某一种微生物的纯培养，是研究和利用微生物的最重要的环节之一。无菌操作技术是微生物学的重要技术，而且广泛地被其它学科和生产实际所利用。2 通过稀释或划线等手段，在琼脂平板上得到微生物的单菌落是最常用的纯种分离手段。3 传代培养、干燥保藏、冷冻保藏是通常使用的微生物菌种保藏技术。 4 微生物个体微小，通常必须通过显微镜才能观察到其个体形态，而进行显微观察时，分辨率和反差是决定显微观察效果的二个最重要的因素。它们与显微镜的特性有关，也取决于样
48、品的制备与观察技术。无论是光学显微镜还是电子显微镜，其设备和技术发展迅速，应用面越来越广泛和深入。5 在显微镜下微生物的大小与形态千差万别，丰富多彩，是区分不同微生物的重要依据之一。（三）连续培养在分批培养的对数生长期中，由于营养物质逐渐耗尽和产生有害的代谢物质，而最终导致生长速度的降低，生长进入稳定阶段。解除分批培养中由于营养物质消耗和产物积累而导致的微生物生长停止。连续培养:细菌在进入对数期时，一方面以一定速度源源不断的输入新鲜的培养液，另一方面缓缓的以同样速度移去培养物（包括菌体和代谢产物） ，可以延长对数生长期，这种培养方法称为连续培养。恒浊连续培养：不断调节流速，使细菌培养液浊度保持
49、恒定恒化连续培养：保持恒定的流速，使营养物质浓度保持恒定6.2 环境条件对微生物生长繁殖的影响微生物与所处的环境之间具有复杂的相互影响和相互作用，一方面，微生物需要从环境中摄入生长和生存所必须的营养物质，只能在一定的环境条件（如温度，湿度及 pH 等）下才能够生存，而环境条件的变化会引起微生物的形态、生理、生长和繁殖特征发生变化；另一方面，微生物也向环境中排泄出各种代谢产物，抵抗和适应环境变化，甚至影响和改变环境。本节主要探讨非生物环境因子，即物理和化学因子对微生物的影响，以及在微生物学研究和应用中如何利用这些影响因素。 环境因子对微生物的影响主要有三种情况： （1）有利于微生物进行正常代谢。 （2）不利于微生物正常代谢，微生物生长受到抑制或被迫改变其原有的一些特征。 （3）恶劣的环境可造成微生物死亡或发生遗传变异。一、物理因素对环境的影响（一）温度的影响致死温度：通常我们把能在 10 min
