1、苏州市莱顿科学仪器有限公司 TEL：0512-66325740第 1 页 共 4 页细菌 DNA 提取方案金葡菌细胞壁厚，不容易破壁。下面我提供几个方法。希望对你有些参考DNA 提取的几种方法 (1).浓盐法 利用 RNP 和 DNP 在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用 1M 氯 纳提取化钠抽提,得到的 DNP 粘液与含有少量辛醇的 氯仿一起摇荡 ,使乳化,再离心除去蛋白质 ,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而 DNA 位于上层水相中,用 2 倍体积95%乙醇可将 DNA 钠盐沉淀出来. 也可用 0.15 MNaCL 液反复洗涤细胞破碎液除去 RNP,再以 1MNaC
2、L 提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿- 异醇法除去蛋白. 两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些. 以稀盐酸溶液提取 DNA 时,加入适量去污剂,如 SDS 可有助于蛋白质与 DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的 DNase 对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂 .通常用.15MNaCL,0.015M 柠檬钠,并称 SSC 溶液,提取 DNA. （2 ）. 阴离子去污剂法: 用 SDS 或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取 DNA .由于细胞中 DNA 与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离
3、子去污剂提取 DNA. （3 ）. 苯酚抽提法: 苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了 DNase 的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与 DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而 DNA 溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含 DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀 DNA 。此时 DNA 是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的 DNA 保持天然状态 . （ 4）. 水抽提法: 利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去 RNA，然后将沉淀溶于水中，使 DNA 充分溶解于水中,离心
4、后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至 2.6M.加入 2 倍体积 95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用 66% 80%和 95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥, 既得 DNA 样品.此法提取的 DNA 中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入 SDS.NaCl/CTAB 法，我一直，比较好用，至少做 PCR 时没有问题。试剂的配制TrisCl(1M,100ml):12.11g Tris 碱溶于 80ml ddH2O 中，加 4.2 ml 浓盐酸，调 pH 至 8.0。最后定容到 100ml。 EDTA(0.5M,100ml):18.61g Na2E
5、DTA2H2O 溶解在 700ml ddH2O 中，用 10M NaOH 调 pH 至 8.0，定容至 100ml。TE 缓冲液(pH8.0):10 mM TrisCl(pH8.0) 、1 mM EDTA(pH8.0)。在 98.8ml ddH2O 中加入 1ml TrisCl(1M,pH8.0), 0.2ml EDTA(0.5M pH8.0)。 HCl(1M):91.38ml ddH2O 中加入 8.62ml 浓盐酸。苏州市莱顿科学仪器有限公司 TEL：0512-66325740第 2 页 共 4 页 NaOH(10M)10% SDS10g SDS 溶在 60ml 水中，加热搅拌助溶。定
6、容至 100ml。NaCl(5M)CTAB/NaCl80mlH2O 中溶解 4.1g NaCl，缓慢加入 CTAB10g，加热搅拌，定容至 100ml。酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）氯仿：异戊醇（24：1）70%乙醇步骤：1： 5ml 细菌培养至饱和状态，取 1.5ml 培养物离心 2min；2：沉淀物加入 567l TE，反复吹打。加 30l 10%SDS 和 3l 20mg/ml 的 proteinase K，混匀，37水浴 1h；3：加 100l 5M NaCl，混匀，再加入 80l CTAB/NaCl，混匀。65水浴 10min；4：加入等体积（720l）的氯仿/ 异戊醇，混匀，离
7、心 4-5min，上清液转入一新管；5：加入等体积的酚/ 氯仿/异戊醇，混匀，离心 5min，上清液转移至一新管；6：加入 0.6 体积的异丙醇，轻混，沉淀 DNA30min，13000rpm 15min，弃上清；7：加入 1ml 70%乙醇洗涤 DNA；8：离心 5min，弃上清，干燥，溶于 40l TE 中。细菌 DNA 提取方案：革兰氏阴性菌，如 E.coli，一般有三种可以选择的方法。一、水煮模板法主要用于 PCR 反应1、接种单菌落于 LB 或脑心平板，连续画线，37 摄氏度培养 1824 小时。2、刮取 12 接种环菌苔加入 150 微升三蒸水中，混匀，100 摄氏度煮沸 10 分
8、钟。3、12000 转/分钟 离心 10 分钟，取上清，20 摄氏度保存备用。操作最简便，对试剂条件要求低。缺点是纯度不够高，可能会含有 RNA、蛋白等杂质。但是作为一般检测目的的 PCR 反应模板已经足够了。有人称扩增 4kb 以下片段都可用此种方法制取模版，编者用此类模板 PCR 可以扩增到 3500bp 的片段。编者建议：此法得到的模版保存时间短，强烈建议每月重新制作一次。二、CTAB/NaCl 法苏州市莱顿科学仪器有限公司 TEL：0512-66325740第 3 页 共 4 页1、接种一单菌落于 5mlLB 中,30培养过夜,2、取 1ml 种子培养液接入 100ml2%LB 中
9、,37 、220r/min 培养 16 小时;3、5000r/min 离心 10 分钟,弃去上清。4、加入 10mlTE 离心洗涤后,用 10mlTE 溶解菌体,混匀,-20 保存备用。5、取 3.5ml 菌悬液,加入 184l10%SDS,混匀, 加入 37l10mg/ml 蛋白酶 K,混匀,37温育 1 小时6、加入 740l5mol/LNaCl,再加入 512lCTAB/NaCl,混匀,65温育 10 分钟。7、加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min 离心 5 分钟,保留上清。8、上清中加入等体积的酚氯仿 异戊醇(25241),混匀,10000r/min 离心 5 分钟,保
10、留上清。9、加入 0.6 倍的异丙醇,混匀,10000r/min 离心 5 分钟, 收集 DNA 沉淀,用 70%乙醇离心洗涤 DNA 沉淀。10、用 1mlTE 溶解 DNA,加入终浓度为 20g/mlRNaseA,4保存。CTAB/NaCl 法提取的 DNA 纯度较高，蛋白杂质较少，保存时间长，编者更喜欢把终浓度为 20g/ml RnaseA加在第 5 步温育的时候，这样最后没有 RnaseA 污染。每一步操作细致一些，得到的 DNA 可用于 Southern blot。编者建议：长时间保存 DNA 可放于-20，但要尽量减少反复冻融，否则影响 DNA 质量。三、盐析法1、1.5ml 对数
11、期菌液2、12000rpm 30 s3、200ul 裂解液（同 CTAB/NaCl 法），37c,1hr4、66ul 5M NaCL,混匀充分，12000rpm 10min5、上清用粗枪头取至新管6、等体积酚充分混匀，12000rpm 3min，反复抽提至无蛋白层7、取水层，等体积氯仿混匀，12000rpm 3min8、上清至新管，2 倍体积预冷无水乙醇9、-20C，20min，14000rpm， 15min10、 400ul 70%冷乙醇洗涤苏州市莱顿科学仪器有限公司 TEL：0512-66325740第 4 页 共 4 页11、干燥，100ul 20ug/ml RNaseA，37C，30min12、 2 倍体积无水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗涤13、干燥，溶于 100ul TE介于方法一和方法二之间，CTAB 虽然取出糖分效果较好，但 CTAB 本身也是有毒的，所以此方法放弃了CTAB。革兰氏阳性菌，由于细胞壁的结构与阴性菌有差别，裂解比阴性菌稍微麻烦一些，可以采取 CTAB/NaCl 法稍加修改，在第四步加入终浓度 2mg/ml 的溶菌酶，37 度温育 1h。实验注意：提基因组最好要将枪头尖剪掉（剪掉以后在酒精灯上迅速过一下，使其断口圆滑）。以免枪头损伤基因组！抽干时最好是风干！
