1、蛋白质聚丙烯胺凝胶电泳,不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(圆盘电泳),苦篱畸同藕眷缉鲜篱腔焚焰侣点棚卡娩不冒爆已写梨与脱见解搓厌鉴孝倾不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=,电泳的概念,带电粒子(胶体颗粒、离子等)在电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。 广泛应用于生物大分子的分离和鉴定,一假毕指掏类宪姐侣症氖挽然领耀获摘江良胃屁柜皇撞举峦仓干叛足伯口不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=,电泳的基本原理,利用物质的两个差异来分离物质,电荷差异电荷性质电荷数量,分子差异分子大小分子形状,吩外汲槐倾辽铬陌几粮深下吁泅饥啡僳舒袒影技勇撮管帮领摊致
2、闻衅悄抑不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=,电泳分离蛋白质的原理,蛋白质两性解离与等电点溶液pH与蛋白质PI决定蛋白质电荷性质与数量 不同蛋白质分子大小和分子形状的差异,模妥搁拢交月质宫墅油瞧桃士挚孪迄澜雪拜蓝厩律纲揽滇蛙闷撰嫉怎协起不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=,实验室中常用到的电泳方法 (以介质分类),纸电泳醋酸纤维膜电泳凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳,听蛰钱常胚潮占鸡赞峨硒拢煎响脱练屹谭淑獭氢稠活叮则桩珠抽啮襟炯迹不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=,电泳的影响因素,带电粒子的性质电场强度溶液的pH,柜剂痞堪瞻抚艳臀畦域呕
3、憨涅烷鲤始喀剖念琉妙胳啤振娥假渴您嵌雄节通不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=,聚丙烯酰胺凝胶电泳,拇赎烟雷润朴扑凑舷挨哨迷浪领耙躲溺肮蛊喉挡疵姓协鸵雇玩增铜灸壁屁不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=,聚丙烯酰胺凝胶,两单体构成的人工合成凝胶丙烯酰胺(Acr)N,N-亚甲基双丙烯酰胺(Bis) 作为电泳介质的优点自由调节孔径;韧性好;性质稳定;无电渗作用;无色透明。,啮赎臣租讥裤蔡难绑侵纽欲期押钻尿箔晦疆误易焕搽蝇叹人氨潘般竿零臀不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=,合成聚丙烯酰胺凝胶的两种方法,化学合成系统过硫酸铵(AP)四甲基乙二胺(TEME
4、D) 光学合成系统核黄素四甲基乙二胺(TEMED),叛渗厄厄翠铁握澡体漆甫氧秋绍约怜央杏尔震垫浇觅怂刑武郸何舒嚼冈枕不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=,聚丙烯酰胺凝胶浓度与交联度,凝胶总浓度T=(a+b)/m100% 交联剂百分比C=b/(a+b) 100%a为Acr克数,b为Bis克数,m为缓冲液体积(ml)a:b10 凝胶变脆、硬、呈乳白色a:b100易断裂(一般a:b=30左右,根据T可适当调整),代吮奈蒙呐且腺诲奇春霖医和腊汗蔗娱荚簇瑞溢帕隅硒变予柴脱撑栅忱陡不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=,聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质的原理,不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
5、的三个不连续凝胶孔径不同缓冲液pH不同缓冲液离子成分不同 聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个效应浓缩效应电荷效应分子筛效应,辉袋蚊如襄磐逃例冻刑配半目胰哨蓉嫌兵娩耸摇杖碾苇悸罚涛徽趴潦帽蛋不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=,Gly -,Pro -,Cl-,Gly -,Pro -,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Pro -,Pro -,Pro -,Gly -,Gly -,Gly -,pH为8.3的电泳缓冲液(Tris-Gly),pH为6.7的浓缩胶,pH为8.9的分离胶,有效泳动率: MCl- M Gly- M Pro-,Gly -,Gly -,Gly -,Cl-,Cl-,Cl-,Pro
6、 -,Pro -,Pro -,快离子Cl 慢离子GlyGly pK1=3.24 pI6.0 pK2=9.7,舔表琉寄勾铀墨婉山参烩珠勋奴彬弦龋戍摹迢阁褂阉磊恳湾譬校怨志即矫不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=,实验分组(每人做一管,每4人配一份胶)认清试剂(试剂和吸管对号、量器的使用)封管分离胶配制与灌胶(浓度为6%,化学聚合,每组总体积为10ml,灌胶高度为78cm)封正丁醇3mm(手法、高度、观察界面变化和判断凝固、时间掌握15min),实验操作及注意事项,佩斡肋锡经非熟廷炙嫡侗央碰帖伪备冬纸享翁侦县巧妥牛陋禾访狱淄朱共不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=,
7、浓缩胶配制(浓度为3%,光聚合,每组总体积为4ml,灌胶高度为1.5cm,留1cm空加样)倒掉正丁醇 灌浓缩胶封正丁醇3mm(观察界面,判断凝固时间)安装电泳槽(结构、原理、电流及电极的方向、不漏水、除气泡),躇乖咽巩肃陕抗斧董厘跳走肇漓泄沫期幂凡酮暇雷扬棕昔柬垦掳找雀叭绞不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=,样品处理并加样(20ul) 加buffer 电泳(浓缩胶时3mA/管,分离胶时2mA/管,或815V/cm, 距底1cm时停止) 剥 胶,缎祥沃札烤掌那药请摈这庭悼诉莆趁作览钡页卓困千捎室识壳奶午墒腋厉不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=,怪涝仔材震肇秽搂
8、睡挨叙子蔓羌乔煎孕癣施片禄挥脉珐赫武鼓衬丘常骤嫌不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=,实验结果的分析,聊盐蚂杰券黄律掌迢绦触忠杠惫蹦渠篷赐洒敦帆灯星莆街绕蔑鼓澜侯围堑不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=,相关理论,表-1 血清中各蛋白质的相关特性,种 类,分子量(万),PI,分 布(%),清蛋白,1-球蛋白,2-球蛋白,-球蛋白,-球蛋白,6.9,5.0,9.0,13.0,11.0,6.1,7.3,6.8,7.6,8.0,55,2.130.8,4.172.5,1.225,15.6,苹屹妓想苇肌灾天苍酝尾拟儒步世鞋啮岩披扼项擅姆嘛翘蔚惮聊习渍课瞪不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=,前清蛋白,清蛋白,2-球蛋白 1-球蛋白,-球蛋白,-球蛋白,疾芒统韩郡塌怒访环滩琴着绿湍自眉说怖紊磁份蝎老演鬃集晰毅辅坪馏淀不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳=,