1、发酵工艺参数控制,微生物的培养方式 发酵条件的影响及控制,1、分批培养 2、补料分批培养 3、半连续培养 4、连续培养,微生物培养方式,1、 分批发酵 简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。,微生物培养方式,单位时间内单位菌体消耗基质或形成产物（菌体）的量称为比速，是生物反应中用于描述反应速度的常用概念,菌体的生长比速：,分批培养中微生物的典型生长曲线,延迟期,衰亡期,延迟期：,指数生长期:,减速期:,静止期：,衰亡期:,1、分批发酵,分批培养的优缺点,优点 操作简单，周期短，染菌机会少，生
2、产过程和产品质量容易掌握 缺点 存在基质抑制的问题，产率低，且不适于测定动力学数据。,1、分批培养,2、补料分批培养,在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。 在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。,微生物培养方式,补料分批培养的优缺点,优点 可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。,缺点 由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌
3、机会,3、半连续培养,在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放），称为半连续培养。某些品种采取这种方式，如四环素发酵,优点 放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。,缺点 丢失了未利用的养分和处于生产旺盛期的菌体，代谢产生的前体也可能被丢失，提炼的发酵液的总体积更大,微生物的培养方式,4、连续培养,发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。 达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。,微生物的培养方式,连续培养的优缺点,优点 可以使发酵过程最优化。发酵周期长，能得到高的产量。,缺点 菌种不
4、稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。,微生物的培养方式,发酵条件影响及控制,1、基质浓度 2、灭菌情况 3、种子质量 4、温度 5、pH值 6、溶解氧,1、基质浓度,发酵培养基对发酵生产非常重要。用于生产贵重商品的培养基的配方一般都不发表，为公司机密。先进的培养基组成是支持高产、稳产和经济的发酵过程的关键因素之一。 基质浓度对产物形成也有影响。培养基过于丰富，会使菌体生长过盛，发酵液变得很粘稠，传质状况变差，对产物合成不利。如酵母生长在高糖浓度下，即使氧气充足，还是会进行无氧发酵而生产乙醇。,2、灭菌情况,培养基的灭菌情况对不同品种的发酵生产的影响是不一
5、样的。 一般随灭菌温度升高、时间延长，对养分的破坏作用愈大。特别是葡萄糖，不宜同其它养分一起灭菌。,培养基灭菌条件对产酶的影响,（1）种龄,种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。,种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。,原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。,3、种子质量,（2）接种量,移入种子的体积 接种量 接种后培养液的体积,过大过小都不好，最终以实践决定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。,4、温度,（1）温度对生长的影响,不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于0260
6、C生长，嗜温菌适应于15430C生长，嗜热菌适应于37650C生长，嗜高温菌适应于650C以上生长,4、温度,每种微生物对温度的要求可用最适温度、最高温度、最低温度来表征。在最适温度下，微生物生长迅速；超过最高温度微生物即受到抑制或死亡；在最低温度范围内微生物尚能生长，但生长速度非常缓慢，世代时间无限延长。在最低和最高温度之间，微生物的生长速率随温度升高而增加，超过最适温度后，随温度升高，生长速率下降，最后停止生长，引起死亡。,（1）温度对生长的影响,微生物受高温的伤害比低温的伤害大，即超过最高温度，微生物很快死亡；低于最低温度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死亡。这就是菌种保藏的原理。,4
7、、温度,（2）温度对发酵的影响,温度影响反应速率 发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。,温度影响生物合成的方向,金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，当温度低于300C时，这种菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到350C时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。 温度还影响基质和氧的溶解度，也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制。,4、温度,（3）最适温度的选择,根据菌种选择,微生物种类不同，所具有的酶系及性质不同，所要求的温度范围也不同。 如黑曲霉生长温度为370C， 谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30320C， 青霉菌生
8、长温度为300C。,4、温度,在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快获得大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速； 在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。 发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。 如黑曲霉生长370C，产糖化酶32340C。谷氨酸产生菌生长30320C，产酸34370C。最适温度选择要根据菌种与发酵阶段做试验。,根据生长阶段选择,（3）最适温度的选择,4、温度,根据培养条件选择,（3）最适温度的选择,温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。 通气
9、条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。 培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。,4、温度,菌生长快，维持在较高温度的时间要短些；菌生长慢，维持较高温度的时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择应根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。,（3）最适温度的选择,根据菌生长情况,5、pH值,pH是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。,发酵过程中pH是不断变化的，通过观察pH变化规律可以了解发酵的正常与否。,发酵过程pH变化的原因,（
10、1）基质代谢,（1）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一 （2）氮代谢 当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。 （3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降,5、pH值,（2）产物形成,某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。,（3）菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。,5、pH值,发酵过程pH变化的原因,pH对发酵的影响,（1）pH影响酶的活性。当pH值抑制菌体某
11、些酶的活性时,菌的新陈代谢受阻,（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行,（3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用,5、pH值,（4）pH影响代谢方向 pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。例如黑曲霉在pH23时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。,选择最适pH的准则：获得最大比生长速率和适当的菌量，以获得最高产量。,5、pH值,最适pH的选择,pH对海藻糖水解酶产生的影响,pH的控制,（1）调节好基础料的pH。基础料中若含有玉米浆，
12、pH呈酸性，必须调节pH。若要控制灭菌后pH在6.0，灭菌前pH往往要调到6.56.8,（2）在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3 ，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等,（3）通过补料调节pH 调节补糖速率、空气流量来调节pH 当NH2-N低，pH低时补氨水； 当NH2-N低，pH高时补(NH4)2SO4,5、pH值,（4）加酸碱调pH,在生长期和生产期的pH分别控制在6.5和7.0时，可使利福霉素B的产率比整个发酵过程的pH维持在7.0的情况下的产率提高14%。,（5）发酵的不同阶段采取不同的pH值,5、pH值,pH的控制,例：pH对L-异亮氨酸发酵的影响（天津科技大学）,菌株最适生
13、长pH控制在6.87.0,(5)发酵的不同阶段采取不同的pH值,5、pH值,pH的控制,不同pH值对菌体的形态影响很大，当pH值高于75时，菌体易于老化，呈现球状；当pH值低于65时菌体同样受抑制，易于老化。而在72左右时，菌体是处于产酸期，呈现长的椭圆形；在69左右时，菌体处于生长期，呈“八”字形状并占有绝对的优势。,发酵过程的pH控制,pH69时，菌体生长旺盛，pH715时，对菌体的产酸有利。因此，在发酵的产酸期产酸较高。采用阶段pH控制模式进行发酵，在发酵中前期控制pH6.9，到48h后pH值为715，到80h后pH值为725。产率2227g/L，产酸率提高1223。,发酵过程的pH控制
14、,溶解氧(DO)是需氧微生物生长所必需的。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往最易成为控制因素。,在28氧在发酵液中的100%空气的饱和浓度只有0.25 mmol.L-1左右。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中溶氧可在几秒（分）钟之内便耗竭，使溶氧成为限制因素。,6、溶解氧,（1）、描述微生物需氧的物理量,比耗氧速度或呼吸强度（QO2）：单位时间内单位重量的细胞所消耗的氧气，mmol O2g-1菌h-1,摄氧率(r)：单位时间内单位体积的发酵液中的微生物所需要的氧量。mmol O2L-1h-1 。,r= QO2 .X,6、溶解氧,微生物对氧的需
15、求,X细胞浓度，kg/L,（2）溶解氧浓度对菌体生长和产物形成的影响,CCr: 临界溶氧浓度, 指不影响微生物呼吸所允许的最低溶氧浓度。对产物而言，便是不影响产物合成所允许的最低浓度。,6、溶解氧,微生物对氧的需求,各种微生物的呼吸临界氧值以空气饱和度表示： 细菌和酵母为3%-10%；放线菌为5%-30%，霉菌为10%-15%。,问题：一般微生物的临界溶氧浓度很小，是不是发酵过程中氧很容易满足？,例：以微生物的摄氧率0.052 mmol O2L-1S-1 计，0.25/0.052=4.8秒,注意：产物的形成和菌体最适的需氧量常常不一样：,头孢菌素 卷须霉素 生长 5% (相对于饱和浓度） 13
16、% 产物 13% 8%,6、溶解氧,微生物对氧的需求,典型的分批发酵中氧浓度的变化规律,CL,一般有一个低谷，在对数生长的末期,6、溶解氧,溶氧浓度的变化及其控制,发酵过程的控制一般策略：,前期有利于菌体生长，中后期有利用产物的合成,溶氧控制的一般策略：,前期大于临界溶氧浓度，中后期满足产物的形成。,6、溶解氧,溶氧浓度的变化及其控制,7、泡沫的控制,(1)机械消泡,借机械作用引起剧烈振动或压力变化起消沫作用，消沫装置可安装在罐内或罐外。,罐内可在搅拌轴上方安装消沫桨，泡沫借旋风离心场作用被压碎。,罐外法是将泡沫引出罐外，通过喷嘴的加速作用或离心力粉碎泡沫。,优点：不需引进外界物质，减少染菌机
17、会，节省原材料， 不增加下游负担。缺点：不能从根本上消除泡沫。,7、泡沫的控制,(2)消泡剂消泡,天然油脂类消泡剂：,玉米油、豆油、米糠油、棉籽油、鱼油、猪油等。,这类物质还可用作碳原，消泡能力不强，保存不好时 容易变质。,7、泡沫的控制,（2）消泡剂消泡,聚醚类消泡剂：,应用较多的有聚氧丙烯甘油、聚氧乙烯氧丙烯甘油。,消沫能力比植物油大10倍以上。,7、泡沫的控制,（2）消泡剂消泡,高级醇类消泡剂：,高碳醇是强疏水弱亲水的线型分子，在水体系里是有效的 消泡剂。,C7C9的醇是最有效的消泡剂，C12C22的高碳醇借助 适当的乳化剂配制成粒度为49m，含量为2050%的 水乳液，即是水体系的消泡剂，其中十八醇是常用的 一种。,还有些成酯，如苯乙醇油酸酯、苯乙酸月桂醇酯等在 青霉素发酵中具有消泡作用，后者还可作为前体。,7、泡沫的控制,（2）消泡剂消泡,硅酮类消泡剂：,最常用的是聚二甲基硅氧烷，也称二甲基硅油。,其不溶于水，单独使用效果很差，常与分散剂一起使用， 适用于微碱性的放线菌和细菌发酵。在pH为5左右的发酵 液中使用效果较差。,
