1、现代化学分离方法与技术课程综合实验1菠菜色素的提取及薄层色谱、柱色谱和HPLC色谱分离比较广东第二师范学院化学系菠菜叶中含有叶绿素、胡萝卜素、和叶黄素等多种天然色素。叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂，也是食用的绿色色素。胡萝卜素的三种异构体中 -异构体具有维生素A 的生理活性，可代替维生素A 使用，也可作为食品工业中的色素使用，最新研究报道， -胡萝卜素还有防癌功能。叶黄素是胡萝卜素的羟基衍生物，在光合作用中能起收集光能的作用。由此可见，叶绿素等天然色素有广泛的用途，对于植物色素的提取与分离就显得很重要了。薄层色谱法具有操作简便、快速、分离效果好、适于微量分析等特点；柱色谱分离适用于较多
2、样品的制备分离；HPLC色谱是最有效的分离手段之一，且这三种方法常用于植物色素的分离。让化学、分析专业的学生掌握植物色素的提取技术和进一步熟悉和掌握色谱分离技术是非常有必要的。1 实验部分1.1 仪器与试剂仪器：布氏漏斗、抽滤瓶、研钵、显微载玻片、毛细管、层析柱（203cm）或25cm酸滴定管、铁架台、固定夹、锥型瓶、胶头滴管、500ml和100ml或250ml和50ml烧杯、食品保鲜膜、橡皮筋、美国戴安公司高效液相色谱仪。试剂和原材料: 石油醚(6090)、甲醇(AR)、无水乙醇(AR)、正丁醇(AR)、丙酮(化学纯)、苯(AR)、乙酸乙酯(AR)、无水硫酸钠（AR）、硅胶G 60型(青岛海
3、洋化工厂,薄层层析用)、薄层层析用中性氧化铝(150目160目)、脱脂棉、新鲜菠菜叶。1.2 制板称取10 g 硅胶G 60型(青岛海洋化工厂,薄层层析用 )，加入适量4% CMC溶液（羧甲基纤维素钠，4g加入1L水中煮沸溶解，静置后取上清液）调成糊状，用研钵研磨，以调均匀和排出气泡后，用薄板涂布器或玻璃棒制成薄层厚0.25 mm 供分析用的薄板，凉干（约需0.5-1.0 h），110 活化1 h，完全冷却后放入干燥器，备现代化学分离方法与技术课程综合实验2用。1.3 样品的制备称取1015g新鲜菠菜叶片，剪碎，置于研钵中，加入2030ml石油醚(6090 )-无水乙醇(32，V/ V) 混合
4、溶液，用保鲜膜包住，适当研磨提取，过滤，用10ml 石油醚清洗滤液，将滤液转入分液漏斗，分2 次加入等体积蒸馏水洗去水溶性物质及乙醇，含有色素的石油醚层用2 g无水硫酸钠干燥，将含色素的石油醚蒸发浓缩至12mL 备用。1.4 薄层层析取制备好的薄层板两块，在离两端约1cm处分别用铅笔划线。用毛细吸管吸取色素提取液点在薄层板上，一张板约点三个点，每次不要点太多，分多次上样，点完一次待挥发干后再重复点样2-3次。展开剂为（1）石油醚(6090 )-丙酮-苯(21.52 ,V/ V) 混合液 （2）石油醚-乙酸乙酯 （3:2） （3）石油醚-苯（3:1） （4）石油醚-苯（2:1）将点样后的薄板置于
5、层析缸内（也可用200ml容器加约3ml展开剂），浸入到展开剂中0.5 cm，于暗处室温展开至上划线（约1015 min），标出斑点位置，计算各斑点 Rf 值。1.5 柱层析称取一定量（约20g）的中性氧化铝(150目160目)，用洗脱剂(91体积比)石油醚-丙酮充分润湿，按湿法装柱法把层析柱填好（填柱长约15cm）。柱的上下端要用脱脂棉把固定相固定，并且固定相中不能有空气。移0.5 mL色素样品溶液至层析柱的顶部，待色素全部进入柱体后，在柱顶小心加入1.5 cm高度的洗脱剂(91体积比) 石油醚-丙酮，当流动相液面接近固定相顶部界面时，然后往层析柱上面装入10 mL 洗脱剂,让洗脱剂逐滴放出
6、，用锥型瓶收集。当第一个有色圈(橙黄色) 将滴出时, 取另一锥形瓶收集，它就是胡萝卜素，约用洗脱剂40 mL。用73 现代化学分离方法与技术课程综合实验3(体积比)石油醚丙酮作洗脱剂，绿色圈下端呈黄色，再加20 mL 洗脱剂洗脱，颜色分层更明显，但速度很慢，总共用去洗脱剂约100 mL。分出第二个黄色带，它是叶黄素。再用311 (体积比)丁醇-乙醇-水作洗脱剂，洗脱叶绿素，速度很快，用洗脱剂约60 mL。1.6 高效液相色谱分析柱层析收集的三个谱带的样品：1. -胡萝卜素；2. 叶黄素；3. 叶绿素直接萃取的色素样品（用氮气吹干溶剂后，加入1 mL甲醇后的色素样品）色谱条件：固定相：C18; 流动相：甲醇=100% ；柱温：28 ；检测器波长:405nm, 430nm, 和450nm；进样体积20 L。定性分析： -胡萝卜素；叶黄素；紫黄质；新黄质；去镁叶绿素a；叶绿素a；叶绿素b2 结果与讨论现代化学分离方法与技术课程综合实验4参考文献1 李好样，等. 菠菜色素的提取与分离. 太原师范学院学报（自然科学版） ，2004，3（3）：6466。2 果秀敏，等. 薄层色谱法分离波长叶片中色素的研究. 河北农业大学学报，2000, 23(2)：101104。
