1、人二倍体细胞（2BS 株）生产终末细胞特异性病毒检测对人二倍体细胞（2BS 株）生产终末细胞进行外源性特异性病毒检测。 方法 运用实时荧光 PCR 法检测人二倍体细胞（ 2BS 株）的生产终末细胞的细胞样本细胞裂解上清液的人鼻咽癌病毒、人巨细胞病毒、人逆转录病毒（HIV） 、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、腺病毒及人单纯疱疹病毒核酸。结果 人二倍体细胞（2BS 株）生产终末细胞的细胞样本中未检测到 8 种外源性特异性病毒核酸。结论 人二倍体细胞（2BS 株）生产终末细胞的细胞样本的外源性特异性病毒检测项目合格。中国药典 （2010 年版 三部）收载的生物制品生产检定用动物细胞基质
2、制备及检定规程首次规定：每次从主细胞库建立一个新的工作细胞库，该工作细胞库的生产终末细胞需进行外源性种属特异性病毒检测1。对特殊外源病毒因子检测的技术方法没有做明确规定，只是提及“可采用适当的体外检测技术” 。本研究为运用实时荧光 PCR 法对人二倍体细胞（2BS 株）的生产终末细胞的细胞样本细胞裂解上清液进行 8 种特异性病毒包括人鼻咽癌病毒、人巨细胞病毒、人逆转录病毒（HIV） 、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、腺病毒及人单纯疱疹病毒核酸检测。结果报告如下。1 材料与方法1.1 材料 1.1.1 主要设备 二级生物安全柜、实时荧光 PCR 仪、核酸提取仪等由四川省疾病预防控制
3、中心微生物检验所提供。所有实验用仪器、设备、耗材均在其验证、校验及使用有效期内使用。1.1.2 试剂 核酸提取试剂和 8 种人种属特异性病毒核酸检测试剂分别购自 Promeaga 公司和上海之江生物科技有限公司。所有试剂均在其有效期内使用。1.1.3 细胞样本 人二倍体细胞（2BS 株）的生产终末细胞的细胞裂解上清液，来源于成都生物制品研究所病毒性疫苗二室。1.2 试验方法及步骤 样本及对照品的核酸裂解处理、试剂配制、加样、PCR 扩增、阈值设定、校准程序、质量控制、试验结果的判断及参考值范围均参照试剂盒说明书进行。2 结果2.1 试剂阳性标准品核酸扩增结果 以乙型肝炎核酸检测为例，使用试剂盒
4、中不同浓度乙型肝炎病毒 DNA 标准品扩增，扩增曲线显示随着 DNA 含量降低，曲线 Ct 值增大，检测灵敏度为 5103 IU/ml，达到试剂盒要求( 图 1).注： HBA DNA 标准品 5106 IU/ml， HBA DNA 标准品 5105 IU/ml， HBA DNA 标准品 5104 IU/ml， HBA DNA 标准品 5103 IU/ml， 阴性图 1 乙型肝炎病毒 DNA 标准品核酸扩增曲线2.2 样本核酸检测结果 细胞样本的 8 种种属特异性病毒核酸检测结果均无特异性扩增曲线，即未检测到种属特异性病毒核酸(表 1)。表 1 细胞样本的核酸检测结果检测项目 检测结果人鼻咽癌
5、病毒 阴性人巨细胞病毒 阴性人逆转录病毒（HIV） 阴性人乙型肝炎病毒 阴性人丙型肝炎病毒 阴性人乳头瘤病毒 阴性腺病毒 阴性人单纯疱疹病毒 阴性3 讨论人二倍体细胞（2BS 株）常被用来作为病毒性疫苗的生产用细胞，是病毒性疫苗生产所需的重要生物材料，同时又是疫苗生产用毒种和细胞的病毒外源因子检测用细胞。而人二倍体细胞（2BS 株）的制备和贮存过程中易受各种外源因子污染，势必给病毒性疫苗的质量带来极大的安全风险。因此，加强人二倍体细胞（2BS 株）的质量控制，尤其对人二倍体细胞（2BS 株）的外源性病毒因子的严格控制，对于提高和保证病毒性疫苗质量的安全性、稳定性和有效性具有重要意义。中国药典
6、（2010 年版 三部）规定：人源的细胞系/株，应检测如人鼻咽癌病毒、人巨细胞病毒、人逆转录病毒、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、腺病毒及人单纯疱疹病毒，但对检测技术方法没有做明确规定1。因此，探索了应用实时荧光 PCR检测上述特异性病毒，通过乙肝病毒 DNA 定量检测实验，灵敏度为 5103 IU/ml，达到试剂说明书要求，说明实时荧光 PCR 用于乙肝病毒核酸检测是可行的。实时荧光 PCR 检测技术是近年发展起来的分子生物学诊断技术,已广泛应用于病毒核酸检测2-6，与传统检测方法比较，具有特异性强、灵敏度高、线性关系好且线性范围宽、操作安全、简便、自动化程度高、能有效控制污染、样本需求量小及检测结果直观等优点，能保证检测的准确性和可靠性，可以推广应用于人二倍体细胞（2BS 株）的生产终末细胞的特殊外源病毒因子（即外源性特异性病毒）的检测。本试验过程中，为了保证检测结果的可靠性，减小因检测操作因素带来的误差，均设立阴性对照和阳性对照。当阴性对照无特异性扩增曲线，阳性对照有特异性扩增曲线时，则该检测试验成立，进而若细胞样本无特异性扩增曲线，则该细胞样本未检出此特异性病毒，即核酸检测结果为阴性。本试验的细胞样本细胞裂解上清液未检测到 8 种外源病毒因子核酸，提示人二倍体细胞（2BS 株）生产终末细胞的细胞样本的种属特异性病毒检测合格。
