离子对试剂.doc

1、离子对试剂介绍离子对试剂的优点在过去，带电荷分析物的 色谱 分离通过离子抑制（小心调节 流动相 PH 值以使分析物非离子化）来达到。然而，要确定离子抑制状态下的最佳流动相 PH 值，却往往需要额外的摸索过程。含有一个以上的可离子化成分的样品，通常是不 稳定的。离子抑制的局限性导致了一种新的、更普遍适用的方法进行可离子化物质色谱分离的方法：离子对色谱。离子对色谱由 Gordon Schill 博士于 1973 年建立，其方法是将离子性化合物添加到流动相中以促使离子与带电荷分析物形成配对离子。 这些试剂由带 有可离子化终端的烷基链组成。当在反相条件下用于常见的憎水性 HPLC 固定相时，离子 对试

2、剂可选择性的增加带电荷分析物的保留时间。尽管离子交换色谱已经成为常见的分离模式，它并非在所有情况下都起作用。较离子交换色谱，离子对色谱的优点在于：缓冲液制备简单；碳链长度选择众多，可用于增加保留 时间、改善分离性质；显著缩短分离时间；同时分离离子化和非离子化分析物；分析结果重现性极好；改善峰形。Regis 提供的离子对试剂Regis 生产超纯的阴离子磺酸 盐（S-系列）和阳离子季胺（Q-系列）离子对浓缩液，碳链长度有：戊、己、庚、辛和月桂(十二)。在我 们的产品命名中，碳链长度以红色数字标出，如：5，6， 7，8和 12。纯度是关键因素在我们生产离子对试剂的过程中， 纯度是非常重要的质量 标准

3、。 Regis S-和 Q-系列离子对试剂根据工业最高质量标准进行合成，从而得到超乎 寻常的 纯度。 这一点可参见表 1：在波长低至 200nm 时对于 Regis S-和 Q-系列离子对试剂均可达到紫外透 过性。在大部分情况下，这些紫外吸收值要低于用于 HPLC 梯度洗脱的乙腈和甲醇的紫外吸收值。尽管 S-和 Q-系列离子对试剂能在低于 210nm 的波长下使用，决定使用什么波长的关键因素还是在于检测器镜片和有机该性剂（如甲醇等）的综合情况。Regis 还提供批量磺酸盐和几种 补充批量离子对试剂以及 Rivier 缓冲剂以补充磺酸盐 S-系列和季胺 Q-系列的分离能力。如何为分析方法的建立选

4、择合适的 Regis 离子对试剂要选择合适的试剂，必须考虑烷烃长 度。不同的 烷烃链长度使得能 够选择性分离分析物。链越长，离子对的憎水性越强，从而，保留时间也就越长。当链长度由戊基(Q5) 增加到月桂基(Q12)时，保留因子几乎增 长了 20 倍，如表 2 和表 3 所示。表 2 和表 3 中的数据显示出 Q-试剂链长度决定了苯甲酸的保留时间，但不会影响到苯甲醇的保留 时间。 对于 S-系列试剂也可以观察到类似的选择性。以下是使用 Regis 离子对试剂 来成功建立分析方法的指导：1. 选择一根色谱柱，常为 C18 柱；2. 准备流动相时仅使用 HPLC 级别的水和色谱级试剂；3. 选择能给

5、出最佳分离度的流动相成分和浓度；4. 如果样品中有非离子化物质，在 尝试离子化分离之前首先 优化分离情况；5. 选择合适的离子对系列试剂以提供相应的离子配对：对于酸性分析物使用 Q-系列离子对试剂；对于碱性分析物使用 S-系列离子对试剂；6. 通过比较选择所得分离度最好的离子对试剂；7. 一旦离子对试剂已经确定， 调节流动相的 pH 值将分离度最大化；因为微小的 pH 值改变对保留性质和选择性都有较大的影响，所以仔 细小心的小幅度 调节 pH 值（参见表 3）；8. 理想状况下，流动相中的离子对试剂浓度应为 0.005M，但是稍微增加离子对试剂可能会稍微增加保留性质并因此优化分离情况。2.2

6、高效液相色谱分离HPLC-ICP-MS 联用技术在元素化学形态分析中的应用，已有文献总结；该技术的优点是应用范围广。以下是几种常用于形态分析的 HPLC 技术。2.2.1 体积排阻色谱(SEC)SEC 是按溶质的分子大小来分离的。其优点是：未知分子质量的样品在末端时间或在此之前淋出，因而可以预测色谱运行的终点；未知物的分子质量可以用校正的色谱系统来表征。SEC 通常不会引起元素形态的丢失，适用于不稳定或与金属络合较弱的生物大分子。缺点是容量有限，不能分辨多组分样品，仅能分离分子大小不同且不能吸附在柱上的分析物。此外，有些化合物的保留时间会迁移至淋洗体积的末端以外，有时还会产生吸附效应和憎水效应

7、，这些现象均会导致化学形态的转变和破坏。2.2.2 离子交换色谱(IEC)与 SEC 相比，IEC 最主要的优点是分离效率高，应用范围广。分离过程基于带电溶质离子与固定相的反电荷表面的交换平衡。溶质离子与流动相中的等电荷离子竞争固定相上的反离子。这种竞争决定了离子的相对保留时间，它依赖于流动相的 pH 值、离子强度和离子交换剂的性质。淋洗液中如含有高浓度的盐类，将会影响与 ICP-MS 的接口。此外不稳定的金属-蛋白的络合物中的金属会被缓冲液中的金属所代替。所以，IEC 经常应用于以共价键结合的硒氨基酸或砷化合物。2.2.3 反相高效液相色谱(RP-HPLC)RP-HPLC 利用极性较流动相弱

8、的固定相来分离分析物。保留机制是基于分析物的憎水性。该方法的应用范围广，对不同形态的分辨率高，重复性好。但是，固定相有离子交换性质，在 pH4 时碱性分析物在柱上的吸附力很强。一般应用两种不同的淋洗液，其中至少有一种含有相当量的有机改进剂。淋洗生物分子需要用有机溶剂，还经常需要用酸。有机溶剂和酸很容易改变形态如蛋白-金属络合物。蛋白质被打开后，释放的金属即与其它络合剂结合导致形态改变。所以，RP-HPLC 适用于分离以共价键结合的金属络合物而不适用于不稳定的金属络合物。2.2.4 离子对色谱(IP-RPLC)RP-HPLC 仅能分离非极性不带电的分析物。在分离带电的极性分析物时需要用离子对试剂

9、。固定相是标准硅烷化的硅胶填料(如 C8 或 C18。)，流动相是由如磷酸盐或醋酸盐、有机改进剂(甲醇或乙腈)和离子对试剂组成的水溶液缓冲体系。离子对试剂与分析物生成离子对保留在反相柱上。离子对试剂参与流动相中分析物与非极性固定相之间的平衡。在考虑离子对试剂时应尽量用溶于流动相的去质子的一价反离子，并对色谱柱和分析物不造成损害。用缓冲溶液控制水相的 pH 值和反离子的浓度以避免峰拖尾和出现多峰至关重要。与 RP-HPLC 相比，IR-RPLC 的优点是方法的灵活性和多样性增加了。可以为一种特定的要求来设计分离条件。但是，方法所用的有机溶剂和酸也会影响元素的形态。离子对试剂更加重了这些问题，于是

10、对分析物的稳定性的要求比单独使用 RP-HPLC 更高。一 、 离 子 对 试 剂 的 定 义 ： 离 子 对 试 剂 是 由 强 亲 水 离 子 形 成 ， 反 作 用 于 样 品分 子 的 中 性 离 子 对 。 因 此 ， 可 用 于 同 时 分 离 带 电 分 子 和 非 带 电 分 子 。 二 、 适 用 范 围 ： 一 般 可 适 用 所 有 色 谱 固 定 相 ， 流 动 相 至 少 含 用 乙 腈 的 情况 下 ） 。 当 使 用 长 链 的 离 子 对 试 剂 时 ， 如 ： 十 六 烷 基 硫 酸 铵 或 十 二 烷 基 硫 酸钠 ， 色 谱 柱 将 选 用 反 相 色 谱

11、 柱 。 三 、 使 用 浓 度 ： 离 子 对 试 剂 的 适 用 浓 度 短 链 离 子 对 试 剂 ： 510-3mol/L 长 链 离 子 对 试 剂 ： 510-4mol/L使 用 液 相 色 谱 法 分 析 电 离 能 力 比 较 强 的 样 品 时 ， 样 品 在 反 相 色 谱 柱 上 的保 留 时 间 很 短 或 者 根 本 不 保 留 ， 这 时 要 加 入 相 应 的 离 子 对 试 剂 ， 将 分 析 物 上的 离 子 进 行 结 合 ， 形 成 在 柱 子 上 有 保 留 的 分 子 。 就 像 是 一 个 物 质 要 穿 色 谱 柱而 过 时 ， 我 们 使 用 离

12、 子 对 试 剂 将 它 留 住 。 离 子 对 试 剂 是 在 高 效 液 相 色 谱 法 中 引 入 了 离 子 色 谱 方 法 的 一 种 表 现 。它 主 要 是 作 用 于 样 品 和 固 定 相 之 间 的 一 种 物 质 ， 所 以 在 选 择 离 子 对 试 剂 时 ，要 考 虑 色 谱 柱 的 调 料 盒 样 品 的 酸 碱 性 。离 子 对 试 剂 的 种 类 和 浓 度 对 分 离 效 果 都 有 较 大 的 影 响 .离 子 对 试 剂 种 类 的 选择 依 赖 于 被 分 离 样 品 的 性 质 .被 分 离 溶 质 是 强 酸 或 强 碱 ,离 子 对 试 剂 可

13、以 是强 酸 或 强 碱 ,弱 碱 或 强 酸 ,弱 酸 ,如 被 分 离 的 溶 质 是 弱 酸 或 弱 碱 ,则 选 用 的 离子 对 试 剂 必 须 是 强 碱 或 强 酸 .对 于 溶 质 结 构 性 质 相 差 较 大 的 混 合 样 品 ,离 子对 试 剂 种 类 的 选 择 并 没 有 特 殊 要 求 .离 子 对 试 剂 疏 水 性 的 差 别 可 以 通 过 调 节离 子 对 试 剂 浓 度 和 有 机 溶 剂 浓 度 获 得 满 意 的 分 离 效 果 。 离 子 对 试 剂 用 于 高 压液 相 离 子 对 萃 取 的 液 相 色 谱 法 分 离 分 析 强 极 性 有

14、机 酸 和 有 机 碱 的 好 方 法 。 广泛 应 用 于 生 物 化 学 ， 药 物 学 ， 和 石 油 化 工 等 领 域 。 一 、 用 于 酸 性 化 合 物 1、 四 丁 基 氢 氧 化 铵 （ 10%水 溶 液 ） 2、 四 丁 基 溴化 铵 3、 十 二 烷 基 三 甲 基 氯 化 铵 二 、 用 于 碱 性 化 合 物 1、 戊 烷 磺 酸 钠 2、 己 烷 磺 酸 钠 3、 庚 烷 磺 酸 钠 4、 辛 烷 磺 酸 钠 5、 癸 烷 磺 酸 钠 离 子 对 试 剂 是 高 效 液 相 色 谱 专 用 试 剂 ， 主 要 分 析 测 试 有 机 碱 类 离 子 化 合物 ，

15、代 替 离 子 交 换 法 ， 具 有 可 靠 的 分 离 效 果 。 也 可 用 于 分 析 多 肽 和 蛋 白 质 ，是 制 备 抗 静 电 聚 脂 纤 维 的 中 间 体 . 常 用 离 子 对 试 剂 1-戊 烷 磺 酸 钠 CAS:22767-49-3 1-己 烷 磺 酸 钠 CAS:2832-45-3 1-庚 烷 磺 酸 钠 CAS:22767-50-6 1-辛 烷 磺 酸 钠 CAS:5324-84-5 1-癸 烷 磺 酸 钠 CAS:13419-61-91. 选 择 一 根 适 合 的 色 谱 柱 ， 常 为 C18 柱 ； 2.准 备 流 动 相 时 仅 使 用 HPLC 级

16、 别 的 水 和 色 谱 级 试 剂 ； 3.选 择 能 给 出 最 佳 分 离 度 的 流 动 相 成 分 和 浓 度 ； 4.如 果 样 品 中 有 非 离 子 化 物 质 ， 在 尝 试 离 子 化 分 离 之 前 首 先 优 化 分 离 情况 ； 5.选 择 合 适 的 离 子 对 系 列 试 剂 以 提 供 相 应 的 离 子 配 对 ： 对 于 酸 性 分 析 物使 用 酸 性 离 子 对 试 剂 ； 对 于 碱 性 分 析 物 使 用 碱 性 离 子 对 试 剂 ； 6.通 过 比 较 选 择 所 得 分 离 度 最 好 的 离 子 对 试 剂 ； 7.一 旦 离 子 对 试 剂

17、 已 经 确 定 ， 调 节 流 动 相 的 pH 值 将 分 离 度 最 大 化 ； 因为 微 小 的 pH 值 改 变 对 保 留 性 质 和 选 择 性 都 有 较 大 的 影 响 ， 所 以 仔 细 小 心 的小 幅 度 调 节 pH 值 （ 参 见 表 3） ； 8.理 想 状 况 下 ， 流 动 相 中 的 离 子 对 试 剂 浓 度 应 为 0.005M， 但 是 稍微 增 加 离 子 对 试 剂 可 能 会 稍 微 增 加 保 留 性 质 并 因 此 优 化 分 离 情 况 。在 过 去 ， 带 电 荷 分 析 物 的 色 谱 分 离 通 过 离 子 抑 制 （ 小 心 调 节

18、 流 动 相 PH 值 以使 分 析 物 非 离 子 化 ） 来 达 到 。 然 而 ， 要 确 定 离 子 抑 制 状 态 下 的 最 佳 流 动 相PH 值 ， 却 往 往 需 要 额 外 的 摸 索 过 程 。 含 有 一 个 以 上 的 可 离 子 化 成 分 的 样 品 ，通 常 是 不 稳 定 的 。 离 子 抑 制 的 局 限 性 导 致 了 一 种 新 的 、 更 普 遍 适 用 的 方 法 进行 可 离 子 化 物 质 色 谱 分 离 的 方 法 ： 离 子 对 色 谱 。 离 子 对 色 谱 由 Gordon Schill 博 士 于 1973 年 建 立 ， 其 方 法

19、是 将 离 子 性化 合 物 添 加 到 流 动 相 中 以 促 使 离 子 与 带 电 荷 分 析 物 形 成 配 对 离 子 。 这 些 试 剂由 带 有 可 离 子 化 终 端 的 烷 基 链 组 成 。 当 在 反 相 条 件 下 用 于 常 见 的 憎 水 性HPLC 固 定 相 时 ， 离 子 对 试 剂 可 选 择 性 的 增 加 带 电 荷 分 析 物 的 保 留 时 间 。 尽 管 离 子 交 换 色 谱 已 经 成 为 常 见 的 分 离 模 式 ， 它 并 非 在 所 有 情 况 下 都 起作 用 。 较 离 子 交 换 色 谱 ， 离 子 对 色 谱 的 优 点 在 于

20、 ： 缓 冲 液 制 备 简 单 ； 碳 链 长 度 选 择 众 多 ， 可 用 于 增 加 保 留 时 间 、 改 善 分 离 性 质 ； 显 著 缩 短 分 离 时 间 ； 同 时 分 离 离 子 化 和 非 离 子 化 分 析 物 ； 有 效 改 善 峰 形 对 色 谱 柱 伤 害 较 大 。 离 子 对 试 剂 会 对 色 谱 柱 造 成 不 可 逆 的 伤 害 ， 离 子 对 试剂 和 固 定 相 结 合 产 生 不 可 逆 吸 附 ， 进 而 影 响 固 定 相 活 性 位 点 。 比 如 十 八 烷 基硅 胶 键 合 色 谱 柱 ， 离 子 对 试 剂 会 影 响 色 谱 柱 键

21、 合 ， 从 而 达 到 分 析 样 品 的 作 用 。这 种 反 应 对 色 谱 柱 影 响 很 大 ， 而 且 离 子 对 试 剂 很 难 从 色 谱 柱 上 冲 洗 干 净 ， 会大 大 缩 短 色 谱 柱 的 使 用 寿 命 。 实 验 条 件 不 稳 定 。 离 子 对 试 剂 的 浓 度 与 其 样 品 的 保 留 时 间 有 直 接的 影 响 ， 而 且 离 子 对 试 剂 对 pH 值 比 较 敏 感 ， 配 制 流 动 相 时 要 求 精 确 度 较 高 。否 则 直 接 影 响 实 验 的 重 复 性 和 重 现 性1、作用原理“加入离子对试剂后，它可以与待分析的物质（多为

22、在溶液状态时显以与离子对试剂相反的电荷）结合成离子对而呈中性，这样非极性就表现出来，从而在色谱柱上有保留行为。”我觉得离子对试剂很像胶黏剂，一头以离子吸引住待测物（也是离子），另一头以碳链与固定性作用，从而把待测物保持在固定相上 。它的优点和缺点，都是因为这样的特性。2、试剂选择“离子对分为正离子对和负离子对，分析酸性样品（确切的说应该是作用基团）用正离子对试剂，分析碱性样品用负离子对试剂。正离子对试剂可以吸附带负电荷的样品组分，负离子对试剂反之。戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠十二烷基磺酸钠都属于负离子对试剂；四丁基溴化铵、四丁基硫酸氢铵一类属于正离子对试剂。离子对要考虑样品体系的复杂性和干扰物的特性

23、，先用原则一般尽可能使用碳链短的先，这样可以避免强保留造成对柱子效能的影响，同时，浓度尽可能的低，以保证对柱子填料的稳定性影响最小及清洗方便。”看来做实验下手轻点儿好，从碳链短的开始，从低浓度开始，不行再慢慢加。不过这次的使用经验是从碳链长度中等的开始，可以更快看到效果，节约摸索分析条件的时间。同时流动相 PH 值尽可能低以确保离子化程度。3、试剂的使用“离子对试剂不一定是表面活性剂，如己烷和庚烷磺酸钠，又如三乙胺活四丁基溴化胺，不具表面活性作用。所以用己烷和庚烷盐就没有泡末，用四丁基溴化胺也不产生气泡。十二烷基磺酸钠（或硫酸钠），或者十六烷基溴化钠（CTAB,一种做阴离子用的阳性表面活性剂）

24、，在浓度高的时候容易产上泡末。做 HPLC 时流动相里加的 SDS 或 CTAB 浓度一般不会太高，一般在 0.1%以下，而且流动相里有甲醇等有机溶剂，高浓度的有机溶剂有破乳的作用，因此，混合后的流动相泡末应该不会很多。另外，做电泳加入的 SDS 量很大的比如做蛋白质 SDS 胶，或者毛细管电泳里的 MECC，SDS 浓度很高，而且没有或者有很少比例的有机改性剂，当然会有气泡，跟 HPLC 不完全相同。”达人们的意思我看明白了，就是有点泡沫不要怕，确保溶液摇匀就好。使用离子对试剂时，调节保留时间的方式与普通反相不同，变化有机相比例没有改变PH 值来得有效。“当流动相 PH 值较高时，样品以中性

25、形式存在，那么正电荷较少，相应的保留较弱；当流动相 PH 值较低时，样品便以质子碱 H+形式的离子状态存在，那么正电荷与固定相上带负电荷的-SO3 强烈吸附，相应的保留会非常强。”“再说明一下 B 物质的 pKa，其值为 10.5，在 pH 为 4.5、3.8 时都以离子态存在，这点没错，虽然都是离子态，都是 99%以上，但从量上说还是有点不一样的。任何物质以离子态存在时都有一个平衡的状态：B（H）（BH），这里存在着一个平衡常数 K（或者说离解常数），于是 pH 不同时，H不同，对应的 B、BH也不同。所以才会出现 pH 不同，保留值会不同。另外我认为 4.5 和 3.8 的 pH 相差不大

26、，其改变对物质的保留值影响不会很大，因为在流动相中还受到很多因素的影响。”4、使用后清洗大家都强调离子对试剂要冲洗较长时间才能洗去。想想也知道那简直是一定的，使用前平衡了老半天呢，要是轻易就能洗去就怪了。对于多数离子对试剂，清洗还是比较简单的，平时的水甲醇就能奏效，只是时间必须长点，2 小时比较好。有些例子比较特殊：“如果用 TBA 的话应该需要好好洗洗柱子，因为这种胺类的东西不容易洗干净，且会慢慢溶解硅胶。 通常 TBA 是用 0.1%的磷酸，（其中含有 100mM 高氯酸钠）与甲醇 1：1 来洗。磷酸的作用是调节 pH, 高氯酸钠可以把胺带下来，甲醇增加对有机物的溶解度。”“根据试验经验，

27、SDS 在酸中的溶解性较差，因为它是强碱弱酸盐，在酸性条件下可以生成不溶于水的弱酸十二烷基磺酸，但此酸在有机相中溶解性较好，所以即使在水相中有不溶解的 SDS，在加入有机相后反而会使之溶解。所以在流动相中不含有其他盐时，完全可以用比例较高的有机相水洗涤。”5、其他很早就知道，醋酸铵可以起部分离子对试剂的作用，没想到 TFA 也可以。“英文文献中是经常称之为 ion-pair reagent 的！而且不只是用来掩蔽填料上残留的活性硅羟基，TFA 的氟端还能与分析物的疏水部分相“配对”呢”“我觉得缓冲液可以更准确的控制所需的 PH 值，而加酸所得到的 PH 值不够稳定，很容易随着温度、流动相组成的微小变化而改变，但是缓冲液中的盐成分对色谱柱的使用寿命来讲不是什么好事。选用酸还是缓冲液来控制流动相 PH 值，最好依据分析方法的耐用性来选择！保留性、选择性对 PH 的变化不是很敏感的话，加酸应该就可以了！另外：磷酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液可以控制的 PH 值范围是不同的！磷酸盐可以控制 PH 值范围在 2.13.1 和 6.28.2醋酸盐可以控制的 PH 缓冲范围是 3.85.8”