1、Western blot 实验操作程序一、储存液的配制：1. )1.5M Tris-HCl（PH8.8）：100mlTris 18.15g去离子水 50 ml缓慢加浓盐酸调 PH 至 8.8（约 4 ml） ，冷却至室温后再加去离子水至 100 ml.2.) 0.5M Tris-HCl（PH6.8）：100ml Tris 6.05g去离子水 50 ml缓慢加浓盐酸调 PH 至 6.8（约 8ml） ，冷却至室温后再加去离子水至 100 ml3. )10%SDS（W/V）：100mlSDS 10g去离子水 100 ml溶解后，室温下保存。4.)50%（v/v）甘油：100ml100%甘油 50
2、ml去离子水 50 ml 混匀后，室温下保存。5. )1%溴酚蓝：10 ml溴酚蓝 100mg去离子水 10ml搅拌至完全溶解，经过滤后使用6. )丽春红 S(Ponceau S)储存液： 100 ml丽春红 S 2g三氯乙酸 30g磺基水杨酸 30g去离子水 100ml混匀后，室温下保存。7. )10转膜液：1000 ml甘氨酸 90gTris 19.3g加去离子水至 1000 ml，PH 在 8.3-8.4 左右.二、工作液的配制：1. 组织（或细胞）裂解液：3 ml 或 5 ml 试剂 初始浓度 终浓度 3 ml 5 mlNaCl 1 mol/L 0.1 mol/L 300l 500lT
3、ris-HCl 1mol/L 0.01mol/L 30l 50lEDTA 0.5mol/L 0.001mol/L 6l 10lAprotinin 1mg/ml 0.001mg/ml 3l 5lPMSF 10mg/ml 0.01mg/ml 30l 50lTritonX-100 3% 1% 1 ml 1.6ml去离子水 1.64ml 2.8mlPMSF（苯甲基磺酰氟）：可抑制蛋白酶的降解作用，有较强的毒性，可严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，使用时需戴手套操作。它在水溶液中不稳定，使用时需新鲜配制（可先配成 10 mg/ml 的储存液，需用异丙醇溶解） 。Aprotinin（抑肽酶）：可抑制组织裂解
4、后释放出的蛋白酶对蛋白质的降解作用。2. 5变性 loading:10 ml1M Tris-HCl（PH6.8） 0.6 ml 60mM50%甘油 5ml 25%10%SDS 2ml 2%1%溴酚蓝 1 ml 0.1%去离子水 0.9ml混匀，在 4oC 下可保存数月。3. 丙烯酰胺储存液（30%）：100 ml 丙烯酰胺 29 g 双丙烯酰胺 1g去离子水 100 ml丙烯酰胺和双丙烯酰胺单体均具有强神经毒性，其作用具有累加性，配制时必须戴手套，防止皮肤接触。搅拌至完全溶解，在 4oC 下可保存数月。4. 4分离胶缓冲液：100 ml2M Tris-HCl（PH6.8） 75 ml 1.5M
5、10%SDS 4ml 0.4%去离子水 21ml 混匀后可在 4oC 下保存数月，配分离胶时使用，注意用时不需再稀释,直接用 4的缓冲液即可5. 4堆积胶缓冲液: 100 ml1M Tris-HCl（PH6.8） 50 ml 0.5M10%SDS 4ml 0.4%去离子水 46ml 混匀后可在 40C 保存数月，配堆积胶时使用，注意用时不需再稀释,直接用 4的缓冲液即可6. 10%过硫酸胺(APS)：5 ml过硫酸胺 0.5g去离子水 5ml分装后，保存于-20 0C7. 电泳缓冲液:1000 mlTris 3g 25 mM甘氨酸 14.4g 192 mMSDS 1g 0.1%加去离子水至 1
6、000 ml，PH 在 8.3 左右。8. 考马斯亮蓝染色液: 1000 ml考马斯亮蓝 R-250 1.0g甲醇 450 ml冰醋酸 100 ml去离子水 450 ml需过滤后使用，可用来染蛋白质.9. 考马斯亮蓝凝胶脱色液: 1000 ml甲醇 100 ml冰醋酸 100 ml去离子水 800 ml可使染色的凝胶脱色,以减低背景。10. 丽春红 S 工作液： 100 ml丽春红 S 储存液 10 ml去离子水 90 ml可用来染蛋白质.11. 1转移缓冲液： 1000 ml10转移缓冲液 100 ml甲醇 200 ml去离子水 700ml可回收利用三、操作步骤：1. 组织（或细胞）的裂解：
7、取所需的组织，如：脑、脊髓或其他组织，操作时动作要快且最好在冰上进行。将其转移到已清洗干净并烘干后的匀浆器中，加裂解液进行匀浆（裂解液的量根据组织块的大小确定） ，匀浆时需将匀浆器置于碎冰块中，且匀浆时间不能太长 （约 3-5 分钟，或匀浆器抽拉 30-40 次） ，抽拉时动作要慢，以减少气泡的产生。若要裂解细胞，所加的裂解液量不能太多，以免蛋白质浓度太低，不易检测。若取培养基收集蛋白质，则不须裂解2. 离心：先启动离心机预冷，将温度降至 4，将裂解后的溶液转移至小管中， （根据溶液的量选取大小合适的小管） ，速度要快，以免蛋白质降解，将小管平衡好之后，放入离心机中离心，转速 30005000
8、 转/分为宜，离心时间 15 分钟左右。3. 蛋白质的变性处理：将离心后的小管取出，吸取上清，转移至另一小管中，吸取时要小心，不要将沉淀吸出，向小管中按 4：1 的比例加变性 loading ，将盖子盖好，用胶带缠紧，将小管插入到一塑料泡沫上，以防止小管沉底，放入沸水中变性，注意：小管中的液体不能太多，以免加热后管子爆开，可将盖子用胶带缠紧，须等水沸腾后将小管放入，不然会影响变性效果，变性时间为 510 分钟离心后立即变性，防止蛋白质的进一步降解。变性后的样品置于 4oC，可多次使用。4.灌胶前的准备：用前须将灌胶用的玻璃板洗干净，烘干，操作时避免用手接触灌胶面，将两侧的隔条上涂抹一层薄薄的凡
9、士林，不要涂得太宽，以免凡士林进入灌胶面，小心将两块玻璃板叠在一起，插入到橡胶框中，将长玻璃板向外倾斜放置，在其底部加 10%的琼脂糖凝胶封底（用前将琼脂糖在微波炉中加热至融化，加热时间不能太长，以免沸腾太厉害，污染微波炉） ，加琼脂糖的目的是防止液体渗漏，待琼脂糖凝固后，将玻璃板及橡胶框轻轻置于电泳槽中，旋紧螺栓，也可再加琼脂糖封边封底，在两玻璃板之间加双蒸水，观察有无液体渗露，若有则需重新封底。5. 灌注分离胶：（根据我室的灌胶设备，配 10ml 即可）灌胶前需根据要检测的组织及蛋白质种类的不同，选用不同浓度的凝胶，常用浓度为 10% 丙烯酰胺溶液（30.8%） 3.4ml4分离胶缓冲液（
10、PH8.8） 2.5 ml去离子水 4.1 ml10%过硫酸胺(APS) 30ulTEMED 5-8ul其中过硫酸胺提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基，而 TEMED 通过催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合。灌胶之前在电泳槽上确定要灌的分离胶的最上液面到达的位置，即将梳子插入到两玻璃板之间，梳子下端下方 1cm 左右处即为分离胶的最上液面，将上述液体充分混匀后，快速加入到两玻璃板之间，加液体时可沿一侧壁加入，以免产生气泡，待分离胶加至所需液面水平时，停止加分离胶，向其中加去离子水，其作用一方面防止分离胶氧化，另一方面可将分离胶的液面压平。APS 和 TEMED
11、的量不能太多，以免凝固太快，形成的凝胶不均匀，以 30-45 分钟凝固为宜。6. 灌堆积胶：4ml待分离胶完全凝固后，将水倒出，再向其中加堆积胶，其配方为：丙烯酰胺溶液（30.8%） 0.67ml4堆积胶缓冲液(PH6.8) 1 ml去离子水 2.3ml10%过硫酸胺(APS) 15ulTEMED 5ul堆积胶的作用为使分散的样品在进入分离胶之前聚集成一条细线，使起跑位置基本一致，待堆积胶灌至离最上方 0.5cm 时，插入梳子，再将液体加满，因堆积胶凝固后会有小部分回缩，需在其上方多加一些，以免形成的加样孔不够长，影响上样量，堆积胶凝固后，将梳子轻轻拔出，拔出时两侧用力要均匀，以免损伤加样孔，
12、若两加样孔之间的凝胶条有倾斜，需将其轻轻扶直，最好将设备置于 4oC 过夜备用，因过夜后凝胶的聚合会更好一些，有利于跑胶。7. 电泳：将电泳槽中加入电泳缓冲液，电泳缓冲液的液面须高于凝胶的最上端，且注意电极的方向（长玻璃板侧对红面，电泳仪的电极与电泳槽的电极相互对应即可） ，将电源打开，观察电流的大小，若电泳缓冲液反复使用次数太多，电流太小，则需更换电泳缓冲液。之后将电源关闭，向加样孔中加入已变性的样品，根据蛋白质的浓度确定上样量，或预先将样品按不同的上样量加入到加样孔中，根据电泳后的条带确定上样量，若是细胞样品，或蛋白质的浓度太低，则需将样品浓缩。在胶的一侧加一 marker，marker
13、的用量约 2-5ul，以确定蛋白质条带的分子量的大小，marker 与样品之间最好隔一加样孔，以利于切割，电泳时，以小电流为好，我室的经验是电压调至 100V，电流约 5mA 左右，同时需将电泳槽放入冷水中，因电泳时有热产生，会影响跑胶，导致中间的样品速度较快而两边的样品速度较慢，跑出的条带不在一条直线上，待溴酚蓝指示剂完全进入琼脂糖凝胶中，停止电泳。8. 考马斯亮蓝染色及脱色：将两玻璃板轻轻分开，使凝胶在一块玻璃板上，去掉分离胶两侧的琼脂糖及堆积胶，将凝胶小心从玻璃板上取下，置于考马斯亮蓝染色液中，过夜，次日将考马斯亮蓝染色液回收，将染色后的凝胶放入内有考马斯亮蓝脱色液的平皿中脱色，可在脱色
14、摇床上摇动以加快脱色，中间换两次脱色液，待背景基本无色时即可，脱色时间不能太长，以免蛋白质条带颜色过浅，将凝胶取出，用保鲜膜包好，置于 4oC 冰箱中保存或照相。9. 转膜将海绵、滤纸和硝酸纤维素膜在转膜液中浸湿备用。摊开转膜夹，先根据需要转膜的凝胶大小确定滤纸及膜的大小，滤纸和膜应比凝胶稍小，将其中一海绵置于转膜夹黑面上方，其上放一层厚的滤纸或 4 层薄滤纸，将凝胶放在滤纸上，它的上方再放膜及滤纸，最上方放另一块海绵，将转膜夹夹好，注意：膜与凝胶之间不能有气泡，因有气泡的部位蛋白质不能转到膜上去，且凝胶两侧的海绵和滤纸不能接触，否则会产生短路，使转膜的效果差，将夹子放入转膜槽内，接通电源，注
15、意电极的方向不能接反，转膜所需的电流为 40mA，过夜或 200mA 左右，1.5-2 小时。10. 丽春红染色：转膜后关闭电源，将膜小心取出，同时可将转膜后的凝胶放入考马斯亮蓝染色液中进一步染色，观察转膜的情况，将取出的膜用丽春红染色，染色几分钟即可，染色时间不宜太长，以看到清楚的条带为宜，用双蒸水漂洗膜，洗去丽春红。11. 封闭：将漂洗后的膜装入大小适中的塑料袋中，向其中加封闭液（3%BSA+5%脱脂奶粉，用 0.1MPBS 稀释） ，室温下 1 小时。12. 加一抗：将膜取出，置于另一塑料袋中，加一抗（利用含 3%BSA+5%脱脂奶粉的封闭液稀释，稀释度根据所选用的抗体确定，一般为 1：
16、1000） ，用封口机将膜封好，4 oC 冰箱中过夜。注意将袋中的气泡排除干净。13. 洗一抗：取出膜，放在平皿中，用含 0.1%Triton 的 PBS 漂洗，室温下每次 10 分钟，漂洗三次。14. 加二抗：将膜放在另一塑料袋中，加偶联辣根过氧化物酶（HRP）的二抗（二抗的性质根据使用的一抗来确定，用含 0.1%Triton 的封闭液进行稀释，稀释度为 1：2000-5000） ，排净气泡，将膜封好，室温下作用 1-1.5 小时。注意二抗的浓度不能太高，以免有较强的假阳性出现。15. 洗二抗：取出膜，放在平皿中，用含 0.1%Triton 的 PBS 漂洗，室温下每次 15 分钟，共漂洗三
17、次。16. 显色（利用 ECL 光化学发光法试剂盒）：取 ECL 液中的 1.2 ml A 液+30ulB 液混匀，作用 5 分钟，将膜从洗涤液中取出，吸干洗涤液，正面朝上，把 ECL 液均匀加在膜上作用 5 分钟左右，吸干 ECL 液，将膜用保鲜膜包好，入暗室操作。17. 曝光，显影，定影：打开压片夹，将膜放在一侧，其上方放置胶片，合好压片夹，作用几分钟到几十分钟，选用不同的曝光时间，取出胶片，进行显影，定影，将胶片在室温晾干即可。18. DAB 法：除了用 ECL 光化学发光法进行显色，也可用常规的 DAB 法显色，其大体步骤为：封闭：将丽春红染色漂洗后的膜装入塑料袋中，加封闭液（3%BS
18、A+5%脱脂奶粉，用 0.1MPBS 稀释） ，室温下 1 小时。加一抗：将膜置于另一塑料袋中，加一抗（用封闭液稀释，稀释度根据所选用的抗体确定，一般为 1：1000） ，4 oC 冰箱中过夜。洗一抗：用含 0.1%Triton 的 PBS 漂洗，室温下每次 10 分钟，漂洗三次。加二抗：加生物素化二抗（二抗的性质针对一抗来确定，用 0.1MPBS 稀释，稀释度为 1：200） ，室温下作用 1-1.5 小时。洗二抗：用含 0.1%Triton 的 PBS 漂洗，室温下每次 15 分钟，共漂洗三次。加三抗：提前 30 分钟配制，A 液+B 液（1：200，用 0.1MPBS 稀释） ，室温下作用1 小时。洗三抗：用含 0.1%Triton 的 PBS 漂洗，室温下每次 10 分钟，漂洗三次。显色：在膜的正面加 0.05%DAB+0.03%H2O2，显色 3-5 分钟，终止反应，将膜凉干保存或照相。
