1、1、细胞破碎,细胞破碎方法：机械破碎法物理破碎法化学破碎法酶促破碎法其它,1.1 机械破碎法,通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法。常用的破碎机械有：组织捣碎机、细胞研磨器、匀浆器等。 按所使用的破碎机械的不同可分为三种方法：捣碎法研磨法匀浆法,1.1.1 捣碎法,利用捣碎机的高速旋转叶片（转速可高达10000r/min）所产生的剪切力将组织细胞破碎。 常用于动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞的破碎，也可以用于微生物，特别是细菌的细胞破碎。 使用时先将组织悬浮于水或其他介质中，置于捣碎机内进行破碎。,1.1.2 研磨法,利用研钵、石磨、细菌磨、球磨等研磨器所产生的剪切力将组织
2、细胞破碎。 常用于微生物和植物组织细胞的破碎。 设备：简单，可采用人工研磨或电动研磨 （可在实验室也可在工业生产中使用）。 助磨剂：精制石英砂、小玻璃球、玻璃粉、氧化铝等，必要时加入。,1.1.3 匀浆法,利用匀浆器（一般由硬质磨砂玻璃制成，也可由硬质塑料或不锈钢等制成）产生的剪切力将组织细胞破碎。 匀浆器：由一个内壁经磨砂的管和一根表面经磨砂的研杆组成，管和研杆必须配套使用，研杆和管壁之间仅有几百微米的间隙。匀浆器的细胞破碎程度较高，对酶活力影响也不大，但处理量较少，高压匀浆器可在工业化生产中应用。 通常用于破碎那些易于分散、比较柔软、颗粒细小的组织细胞。 注意：大块的组织或者细胞团需要先用
3、组织捣碎机或研磨器械捣碎分散后才能进行匀浆。,1.2 物理破碎法,通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，多用于微生物细胞的破碎。 常用的物理破碎方法： 温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法,1.2.1 温度差破碎法,利用温度的突然变化，细胞由于热胀冷缩的作用而破碎的方法 对于那些较为脆弱、易于破碎的细胞，如革兰氏阴性细菌等，有较好的破碎效果。 注意：在撮酶进，不能在过高的温度下操作，以免引起酶的变性失活。 此法难于工业化生产。,1.2.2 压力差破碎法,常用方法： 高压冲击法 突然降压法 高压冲击法在结实的容器中装入细胞和冰晶、石英砂等混合物，然后用活塞或冲击锤以
4、高压冲击，冲击力可达50500MPa，从而使细胞破碎。,突然降压法,将细胞悬浮液装进高压容器，加高压至30MPa甚至更高，打开出口阀门，使细胞悬浮液迅速流出，出口处的压力突然降低到常压，细胞迅速膨胀而破碎。又叫爆炸式降压法。破碎效果取决于： 压力差（3MPa） 压力降低速度（速度效果） 细胞种类与生长期（对数生长期的G菌效果较佳）,1.2.2 压力差破碎法,渗透压变化法：利用渗透压的变化使细胞破碎。 此法特别适用于膜结合酶、细胞间质酶等的提取，但是对革兰氏阳性菌不适用（由肽多糖组成的细胞壁可以承受渗透压的变化而不致细胞破裂） 。 一般步骤：分离对数生长期的细胞悬浮在高渗压溶液（如20%左右的蔗
5、糖溶液等）中平衡离心收集细胞迅速投入4左右的蒸馏水或其他低渗溶液中细胞破碎,1.2.3 超声波破碎法,利用超声波所发出的1025kHz的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用而使细胞破碎。 影响因素：输出功率、破碎时间、细胞浓度、溶液黏度、pH值、温度、离子强度等。必须根据细胞的种类和酶的特性来选择。 一般操作条件：频率1020kHz；输出功率100150W；温度010；pH47；处理时间315min；可视具体情况在冷库或置于冰浴中，并采用间歇操作。 特点：简便、快捷、效果好等，特别适用于微生物细胞的破碎，最好采用对数生长期的细胞。,1.3 化学破碎法,通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细
6、胞破碎的方法。 常用化学试剂：有机溶剂（甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）；表面活性剂（特里顿Triton 、 吐温Tween等） 原理： 有机溶剂:使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透性，使细胞内物质释放到细胞外。低温下防止酶变性失活。,1.3 化学破碎法,表面活性剂：有离子型和非离子型两种，可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞的透过性。离子型破碎效果好，但会破坏酶的空间结构，所以一般采用非离子型的，如吐温、特里顿。,1.4 酶促破碎法,通过细胞本身的酶系（自溶法）或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏而达到破碎细胞的目的的方法。 自溶法：效果取决于温度
7、、pH 、离子强度等条件，还可以添加少量的甲苯、氯仿、叠氮钠等防腐剂，以防止其他微生物在自溶细胞液中生长。 外加酶法：根据细胞外层结构的特点，选择使用适当的酶，控制好各种条件，使细胞壁受到破坏，并在低渗压的溶液中使细胞破碎。,1.5 破碎方法的选择,根据破碎细胞的目的、回收目标产物的类型和它在细胞中所处的位置，选用合适的方法. 一般性原则：若提取的产物在细胞质内，需用机械法，若在细胞膜附近则可用较温和的非机械法，若提取的目的产物与细胞膜或壁相结合时可采用机械法与化学法相结合，以促进产物溶解度的提高或缓和操作条件，但保持产物的释放率不变。,1.6 细胞破碎技术研究应注意的几个方面,多种破碎方法相
8、结合 与下游过程相结合 与上游过程相结合 用基因工程的方法对菌种进行改造,2 提 取,在一定的条件下，用适当的溶剂（溶液）处理原料，使欲分离物质充分溶解到溶剂（溶液）中的过程，又称为抽提。常用的溶剂:水、稀盐、稀酸、稀碱或甘油等较缓和的试剂。影响提取的主要因素: 提取物质的结构与性质（与溶解度有 关）、温度、溶液粘度、扩散速度、 扩散面积等。,2.1 提取方法,盐溶液提取 盐溶现象：大多数蛋白质都溶于水，而且在低浓度盐存在的条件下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加。而在盐浓度达到某一界限后，蛋白质的溶解度随盐浓度升高而降低（盐析现象）。所以，一般采用稀盐溶液进行蛋白质的提取。RNA、DNA也
9、可以用此法提取。,酸溶液提取适采用对象：在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好的生化物质。如胰蛋白酶可用0.12mol/L硫酸溶液提取。注意: 提取时溶液PH值不能太低，以免发生变性失活现象，常选用PH3-6的范围。,碱溶液提取适采用对象：在碱性条件下溶解度较大且稳定性较好的蛋白质。如细菌L-天门冬酰胺酶可用pH11-12.5的碱溶液提取。 注意: 操作时PH值不能过高，以免影响酶的活性。,有机溶剂提取与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的蛋白质，可采用与水可以混荣的乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂提取。如胆碱酯酶可用丁醇提取；胰岛素可用60%-70%的酸性乙醇提取等。RNA和DNA可用苯酚水溶液提取。
10、,2.2 影响提取的因素,在提取过程中，受各种外界条件影响。主要影响因素是物质的溶解度以及物质向溶剂相扩散速度。同时受到温度、pH值、提取液体积等提取条件的影响。,溶解度,极性物质易溶于极性溶液中，如大多数蛋白质、核酸等可用水溶液提取。脂类和某些与脂质结合牢固或分子中含有较多的非极性基团的蛋白质等，易溶于有机溶剂，可用有机溶剂提取。,扩散速度扩散速度越大，提取效果越好。一般而言，提高溶液温度、降低溶液粘度、增加扩散面积、增大两界面的浓度差等都有利于提高扩散速度。,温 度,提取时的温度对提取效果有明显影响。适当提高温度，可提高物质溶解度，但温度过高，会引起蛋白质、核酸等分子变性失活。,pH值溶液
11、的pH值对蛋白质等两性电解质的溶解度和稳定性有显著影响。在某一特定的pH值条件下，两性电解质所带正、负电荷相等，净电荷为零，此时的pH值为该分子的等电点，此条件下，两性电解质的溶解度最小。因此，提取时pH值应避开其等电点。,提取液的体积增加提取液的用量，课提高物质的提取率。但提取液不宜过量，会使物质浓度降低，对进一步分离纯化不利。提取液总量一般为原料体积的3-5倍。,此外，原料颗粒体积小、适当的搅拌、适当延长提取时间等可使更多生化物质溶解出来。注意：在提取过程中，为提高物质稳定性，以免失活，可适当加入某些保护剂。如酶提取时，适当加入辅酶、抗氧化剂等。,3 沉淀分离,沉淀分离：通过改变某些条件或
12、添加某种物质，使某溶质在溶液中的溶解度降低，从溶液中沉淀析出，而与其他溶质分离的方法。,沉淀分理的方法,盐析沉淀法 等电点沉淀法 有机溶剂沉淀法 金属盐沉淀法 复合沉淀法 选择性变性沉淀法,3.1 盐析沉淀法,利用溶质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在溶液中添加一定浓度的中性盐，使某种物质从溶液中沉淀析出，从而与其他组分分离。,盐析沉淀的原理,盐析沉淀常用于蛋白质等的分离。 盐溶：在低盐浓度下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加； 盐析：在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质析出。,原理,当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质
13、，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。,蛋白质在溶液中的溶解度与溶液的离子强度之间存在以下关系：式中，S： 蛋白质在离子强度为I时的溶解度（g/L）;S0： 蛋白质在离子强度为 0时（即在纯溶剂中）的溶解度（g/L) Ks: 盐析系数;I: 离子强度.,在温度和pH值一定的条件下，S0为一常数，可得下式:式中 ,它主要取决于蛋白质的性质，也与温度和pH有关，当温度和pH一定时，为一常数。Ks为盐析系数，主要决定于盐的性质，其大小与离子价数成正比，与离子半径和溶
14、液的介电常数成反比，也与蛋白质的结构有关。,当和Ks确定后，蛋白质在盐溶液中的溶解度决定于离子强度I。离子强度（I）：溶液中离子强弱的程度，与离子浓度和离子价数有关。I=0.5miZi2式中：mi ：离子强度（mol/L）Zi ：离子价数,Ks 分段盐析：在一定的温度和pH条件下（为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离。分段盐析：在一定的盐和离子强度的条件下 （KsI为常数），通过改变温度和pH值，使不同 的蛋白质分离。,盐的选择,蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，其优点： 温度系数小而溶解度大，不影响酶的活性； 分离效果
15、好； 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用； 价格便宜，废液不污染环境。缺点： 缓冲能力较差； 铵离子的存在会干扰蛋白质的测定。,硫酸铵浓度的调整方法,蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法有两种： 法一：当蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵 浓度不高时，可加入饱和硫酸铵溶液。盐析时所需添加的饱和硫酸铵溶液的体积可按下式计算：V : 所需添加的饱和硫酸铵溶液的体积;V0 :原溶液的体积；S2 :所需达到的硫酸铵饱和度；S1 ：原溶液的硫酸铵饱和度。,法二：直接加入固体硫酸铵，其加入量可按下列公 式计算：S2:所需达到的硫酸铵饱和度；S1 ：原溶液的硫酸铵饱和度。t : 将1L S1饱和度的溶液
16、提高到S2 饱和度时所需 加 入的硫酸铵克数；G与A:常数，与温度有关。,盐析时的注意事项,要保证加入的硫酸铵的纯度要高； 从同一种溶液中欲分离几种蛋白质时，可采用分段盐析的方法； 盐析操作一般在室温下进行，而某些对热特别敏感的酶，则应在低温下进行； 要控制好溶液中蛋白质的浓度，尽可能避免共沉淀作用； 盐析后，须采用透析，凝胶层析，膜分离等方法进行脱盐处理。,3.2 等电点沉淀法,通过调节溶液的pH值至某种溶质的等电点,使其溶解度降低,沉淀析出,而与其他组分分离的方法称为等电点沉淀法。,等电点沉淀法的原理,在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时,该两性电解质的净电荷为零,其分子间的静电
17、斥力消除,使分子能聚集在一起而沉淀下来,所以两性电解质在等电点时的溶解度最低。,注意事项,因在等电点时两性电解质分子表面的水化膜仍然存在,使酶等大分子物质仍有一定的溶解性,导致沉淀不完全。所以在实际使用时,等电点沉淀法往往与其他方法（如盐析沉淀,有机溶剂沉淀和复合沉淀）一起使用。 在加酸或加碱调节pH值的过程中,要一边搅拌一边慢慢加酸或加碱,以防止局部过酸或过碱而引起酶变性失活。,3.3 有机溶剂沉淀法,利用欲分离物质与其他杂质在有机溶剂中溶解度的不同,通过添加一定量的某种有机溶质,使某种溶质沉淀析出,从而与其他组分分离。,有机溶剂沉淀法的原理有机溶剂之所以能使某些溶质沉淀析出,主要是由于有机
18、溶剂的存在会使溶液的介电常数降低,同时,对于具有水膜的分子来说,有机溶剂与水相互作用,使溶质表面的水膜破坏,也使其溶解度降低而沉淀析出。,注意事项,必须在低温条件下操作,而且沉淀析出后要尽快分离,尽量减少有机溶剂的影响。 其分离效果易受到溶液pH值的影响,一般应将溶液的pH值调节到欲分离物质的等电点附近。 在利用有机溶剂进行蛋白质的沉淀分离时,要添加0.05mol/l左右的中性盐，但不宜多加。,3.4 复合沉淀法,在溶液中加入某些物质,使它与蛋白质等形成复合物而沉淀下来.从而达到分离的方法称为复合沉淀法。常用的复合沉淀剂:单宁,聚乙二醇,聚丙烯酸等高分子聚合物。,3.5 金属盐沉淀法,利用溶液
19、中某种溶质与某些金属离子反应,生成金属盐沉淀,而与其他组分分离的方法,称为金属盐沉淀法。 常用的金属沉淀法:有钙盐沉淀法,铅盐沉淀法等。 例子:在核酸提取液中加入一定体积比的氯化钙,使DNA和RNA形成钙盐。,3.6 选择性变性沉淀法,选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来,而与目的物分开,这种分离方法称为选择性变性沉淀法。 例子:对a-淀粉酶等热稳定性好的酶,可以通过加热进行热处理,使大多数杂蛋白受热变性沉淀而除去。,选择性溶剂沉淀法,核酸的沉淀分离,可以选择适宜的溶剂进行处理,使蛋白质杂质变性沉淀而获得核酸,这种方法又称为选择性溶剂沉淀法。 例子:在DNA和RNA的混合液中,用异丙醇选择性的沉淀DAN,而RNA留在溶液中。,注意事项,由于选择性变性沉淀法是使杂质变性沉淀，又对目的产物没有明显影响，因此应用本法前，须对欲分离物质以及溶液中的杂蛋白等杂质的种类、含量及其物理化学性质有较全面的了解。,Thank you!,
