1、细胞培养一般方法 1.玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒：高压蒸汽灭菌 15 分钟以上；2.无菌工作台先用 75%酒精擦拭干净,紫外线照射 30 分钟；3.培养基(pH7.2) 和血清配制好后要做无菌试验：将血清按 10%加入培养基内，用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基 5-10ml 置培养箱内培养 2-3 天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置 4保存；4.消化液(pH7.8) 或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌，分装成支置-20保存；5.进入操作时应佩带手套，然后用 75%酒精擦拭，操作时注意无菌台内空间层次，手及物品不要在暴露的瓶口上方来往。复苏1.应遵守慢冻快融的原则：
2、先将水温锅调至 37-37.5,取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化；2.在无菌台内将完全培养基加入 15ml 的离心管内，约 5ml 左右，然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞，放入离心管中，离心机平衡后 800rpm 离心 3 分钟。（目的是去除冻存液中的 DMSO，减少其对细胞生长的影响）；3.离心后，弃去培养基，重新加入 5ml 左右培养基，轻轻吹匀后，取出放于培养皿/瓶，并根据培养皿/瓶的大小补入相应的培养基，轻轻左右上下晃动，使细胞均匀平铺于底物，然后平放于二氧化碳培养箱内培养。传代1.贴壁细胞：对于贴壁细胞应先吸(倒) 尽培养基,加入 PBS 洗一次，去除血清对
3、胰酶抑制作用，加入胰酶，晃动使胰酶铺均匀置 37 度培养箱约 1 分钟,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻拍打培养皿/瓶,使细胞全部脱落,加入 2-3ml 完全培养基后,轻轻吹打,使细胞基本成单个悬浮,然后分置其它无菌培养皿/瓶内,加入完全培养基后继续培养或实验。2.悬浮细胞：一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内，加入完全培养基继续培养，如要高浓度可先离心 800rpm,3min 后加入完全培养基，轻轻吹匀后，分置其它培养皿/瓶内加入完全培养基继续培养。冻存1细胞：选对数生长期细胞，收集细胞 24h 前换液一次。 2计数：按常规方法把细胞制成细胞悬液，计数，令细胞密度达 10106/ml。 32X 冻存液：含 10的 DMSO、20%FBS 的细胞培养用的培养基。一滴滴加入离心管中，加入与细胞悬液相同体积的冻存液，然后用吸管轻轻吹打混匀。 4分装：分装入无菌冻存管中，每冻存管加 1 毫升细胞悬液。 5封口：用塑料冻存管时拧紧瓶口即可；注明：细胞名称，冻存日期，以便日后查找。6. 冻存：将标记好的冻存管放到室温状态的冻存盒里，（并确保冻存盒里异丙醇达到所需要的刻度），将冻存盒旋紧置于-80冰箱，过夜，然后将冻存管转移到液氮罐中，并做好相应的位置登记管理。
