1、青岛农业大学毕 业 论 文（设计）2014 年 6 月 6 日目录摘要 .IAbstract.II1 引 言 .11.1 立项背景及依据 .11.2 研究现状 .11.2.2 抗氧化协同作用研究现状 .31.3 主要研究内容 .42 材料与方法 .42.1 材料 .42.1.1 原料 .42.1.2 试剂 .42.1.3 仪器 .52.2 方法 .52.2.1 多糖、多肽、皂苷等活性物质的提取及制备 .52.2.2 四种提取物含量测定 .62.2.3 不同提取物抗氧化实验 .72.2.4 提取物与香菇多糖配比增效实验 .72.2.5 最佳搭配物质与香菇多糖的抗氧化最佳配比实验 .83 结果与讨
2、论 .83.1 四种提取物抗氧化能力的测定 .83.1.1 四种提取物还原能力测定 .83.1.2 四种提取物清除 DPPH能力测定 .93.1.3 四种提取物清除羟自由基活性结果 .93.2 三种提取物对香菇多糖的抗氧化增效实验 .113.2.1 三种提取物与香菇多糖复配物还原能力测定结果 .113.2.2 三种提取物与香菇多糖复配物 DPPH清除能力实验 .113.2.3 三种提取物与香菇多糖复配物OH 清除能力实验 .123.3 最佳增效剂与香菇多糖抗氧化配比实验 .133.3.1 不同配比复合物还原能力的测定 .133.3.2 不同配比复合物清除 DPPH能力测定 .143.3.3 不
3、同配比复合物清除羟自由基能力测定 .144 结论 .15致谢 .16参考文献 .17青岛农业大学学士学位论文 香菇多糖抗氧化增效剂的研究I香菇多糖抗氧化增效剂的研究 食品质量与安全专业 任嘉玮指导教师 王凤舞摘要：本文研究了大豆多肽、大枣多糖、三七皂苷对香菇多糖抗氧化能力的协同增效作用。采用复合酶法制备香菇多糖，微波辅助提取大枣多糖、碱溶酸沉协同酶解法制备大豆多肽、醇提法制备三七皂苷。将大豆多肽、大枣多糖、三七皂苷与香菇多糖分别进行体外还原能力，清除OH 和 DPPH能力的测定。再按照一定的比例分别与香菇多糖复配后进行上述三种活性测定，得到最佳的协同抗氧化增效剂。结果表明，还原能力：三七皂苷香
4、菇多糖大枣多糖大豆多肽，DPPH清除能力：香菇多糖三七皂苷大枣多糖大豆多肽，OH 清除能力：三七皂苷香菇多糖大枣多糖 大豆多肽。抗氧化协同实验结果表明：大枣多糖和三七皂苷对香菇多糖有协同增效作用，其中大枣多糖的增效作用最强，基本上能提高 10%左右。在香菇多糖和大枣多糖的质量比为 7: 3 时协同抗氧化能力最强。综合分析，大枣多糖为三种物质中香菇多糖抗氧化能力的最佳增效剂。关键词：香菇多糖；大枣多糖；大豆多肽；三七皂苷；抗氧化；协同增效青岛农业大学学士学位论文 香菇多糖抗氧化增效剂的研究IIEffects of Peptides, JDP and PNS on Antioxidant Acti
5、vity of LentinanStudent majoring in Food Quality and Safety REN Jiawei Tutor WANG Fengwu Abstract: To know the synergistic effect of jujuba polysaccharide, soybean peptides and panax notoginseng saponins on antioxidant activity of Lentinan. Four antionxidant components were extracted to test the ant
6、ioxidant activity (the reducing power, the ability of scavenging DPPH and OH) and compared these abilities of the mixture which are mixed with Lentinan, respectively. Then choose the best antioxidant mixture and adjust the proportion of them in antioxidant activity experiment. And Lentinan (Len) was
7、 obtained by composite enzymatic method, Jujuba polysaccharide (JDP) was extracted by the microwave method, soybean peptides was made by acid precipitation and the composite enzymatic method, panax notoginseng saponins (PNS) was extracted by alcohol precipitation method. The results demonstrated tha
8、t the reducing power: PNSLenJDPpeptides; the ability of scavenging DPPH: LenPNSJDPpeptides; the ability of scavenging OH: PNS Len JDP peptides. The synergistic effect experiments demonstrated that JDP and PNS both have good synergistic effect, but JDP uncommonly increased the Lens antioxidant activi
9、ty, basically increased by 10%. Therefore, JDP has the best synergistic effect of antioxidant activity in the three extracts. The best antioxidant ratio of PNS to JDP is 7: 3.Key words: Lentinan(Len); Jujuba polysaccharide(JDP); soybean peptides; panax notoginseng saponins(PNS); antioxidant activity
10、; synergistic effect青岛农业大学学士学位论文 香菇多糖抗氧化增效剂的研究11 引 言1.1 立项背景及依据多糖具有广泛的药理作用，如作为免疫调节剂，促进细胞因子生成，活化补体；抗肿瘤、抗病毒、抗感染、抗消化性溃疡、抗氧化、防衰老、降血糖血脂等，而且毒性相对较低。香菇（Lentinus edodes）是侧耳科（Pleara taco）的担子菌，含有多种有效药用成分，其中香菇多糖（Lentinan，LNT ）是目前研究很热门的话题。研究表明，香菇多糖具有抗肿瘤、抗病毒、调节免疫、抗氧化和刺激干扰素形成等功能并且对正常细胞不产生毒副作用 1。大豆多肽是大豆蛋白经酶促水解后制得的一
11、定分子量范围的多肽混合物，以 36 个氨基酸组成的小分子肽为主，还含有少量大分子肽、游离氨基酸等成分 2。不仅能为人体提供生长发育所需的氨基酸、能量等，还具有防病治病和提高人体免疫力的功效。大枣为鼠李科植物的成熟果实，可药食两用。大枣富含糖类、纤维素、维生素、氨基酸、蛋白质、矿物质等营养成分，特别是含有多糖、芦丁、环磷酸腺苷(c-AMP)等活性成分，这些成分使红枣具有多种生物保健功能。大枣中的多糖成分具有多种生物活性，能提高机体的免疫能力，且对正常细胞无毒副作用，是理想的免疫增强剂 3。三七（Panax notoginseng）为五加科人参属植物， 以干燥的根入药，是我国特有的名贵中药材，也是
12、我国最早的药食同源植物之一。三七总皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）是三七的活性成分。据现代化学和药理学研究发现在抗氧化损伤、抗衰老、提高机体免疫力等方面的药理作用显著优于人参总皂苷，对脑血管缺血缺氧损伤、脑缺血再灌注损伤有保护作用，对脑神经细胞凋亡有抑制作用 4。衡量某一物质的抗氧化效果，采用体外抗氧化体系时，由于抗氧化作用机制不同，有可能产生的结果也不一致，所以一般要求至少采用两种方法来衡量样品的抗氧化活性。本实验以香菇多糖为主要研究对象，采用 3 种抗氧化活性检测方法（还原能力测定，清除OH 和 DPPH能力测定）研究大豆多肽、大枣多糖及三七皂苷对香菇多
13、糖抗氧化的协同作用，以期为食品资源的开发利用提供更多的理论依据。1.2 研究现状 青岛农业大学学士学位论文 香菇多糖抗氧化增效剂的研究21.2.1 多糖、皂苷和多肽抗氧化性质研究现状1.2.1.1 抗氧化多糖多糖的抗氧化研究较多，主要集中在真菌及有功效的植物中。黄磊 5测定三种不同多糖组分在邻苯三酚自氧化体系和 Fenton 体系中清除自由基的能力，得到抗氧化能力由强到弱依次为 Len-40Len-60Len-80。张全斌等 6采用体外实验研究海带褐藻多糖硫酸酯对超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH的清除作用以及对 H2O2 诱导的红细胞氧化溶血和大鼠肝匀浆脂质过氧化的保护作用。结果表明海带褐
14、藻多糖硫酸酯对超氧阴离子自由基具有良好的清除作用，IC 50 为20.3g/mL。其对羟自由基的清除作用较弱，对 DPPH的作用很弱。滕利荣等 7研究了热水法及复合酶法提取百合多糖(LBP)的最佳条件，发现复合酶法提取的多糖在体外的抗氧化活性均显著高于热水法提取的多糖，对超氧阴离子及羟自由基有抑制作用。冯义莉等 8对香菇发酵液中多糖成分进行研究，得到其抗氧化活性。徐桂兰等 9提取香菇和鸡腿菇中的多糖，测定多糖抗食用油脂的氧化作用。利用Fenton 反应检测其对羟自由基的清除作用，对超氧阴离子自由基的清除作用以及在模拟胃液条件下清除 NO2-的作用。结果表明：两种多糖提取物都具有体外抗氧化性能，
15、香菇多糖提取物的抗活性氧自由基能力和清除 NO2-的能力优于鸡腿菇多糖提取物。亓树艳等 10通过设计正交试验优化水浸、超声和微波等方法提取大枣多糖的工艺，并通过体外抗氧化研究得到在多糖提取率以及抗氧化作用效率。其中微波法提取大枣多糖效果最佳。0.0750.135 mg/mL 大枣多糖对羟自由基最大清除率为 48.5（微波法） 。1.2.1.2 抗氧化皂苷周琳，曾英等 11通过正交实验得到提取三七总皂苷的最佳方法为超声复合酶法。提取液中总皂苷含量为 10.33%，提取物得率为 35.17%。王步江等 12以苦瓜皂苷对超氧阴离子自由基、羟基自由基的清除率作为考查指标，确定了苦瓜皂苷的最佳提取工艺条
16、件为：乙醇浓度 70%，料液比 l:15，温度 55，提取时间2.5h。0.4mg/mL 苦瓜皂苷对超氧阴离子自由基的清除率达到 92.5%，对羟基自由基(OH)的清除率达到 78.9%。李鹏，李绍平 13等以三七总皂苷、人参皂苷Rb1 和人参皂苷 Rg1 含量为指标，得到以甲醇为溶剂，药材粒径为青岛农业大学学士学位论文 香菇多糖抗氧化增效剂的研究30.30.45mm，提取温度 150，提取压力 6.895MPa，提取 15min，提取 1 次时，能高效提取三七皂苷类成分。1.2.1.3 抗氧化多肽植物抗氧化肽的研究很多，主要集中在豆类、玉米等。大豆蛋白是目前研究地最多的植物抗氧化肽原料。刘秀
17、红等 14以大豆为原料，利用木瓜蛋白酶进行水解，制备了大豆抗氧化肽。吴永沛等 15也以大豆为原料，采用固态发酵法获得活性较强的抗氧化肽。包怡红等 16以山核桃为原料，采用混合的风味蛋白酶，制备出具有较强清除自由基能力的山核桃肽。程云辉等 17以麦胚为原料，通过碱性蛋白酶水解，发现其蛋白水解液具有很强的超氧阴离子自由基清除能力。刘宇等 18以鹰嘴豆为原料，利用碱性蛋白酶水解，制得了抗氧化能力强于鹰嘴豆蛋白和大豆蛋白的鹰嘴豆肽。1.2.2 抗氧化协同作用研究现状阮征等 19研究菜籽多酚、Vc、菜籽多酚与 Vc 混合物在化学模拟体系中清除超氧阴离子自由基与羟自由基的能力。结果表明菜籽多酚、Vc、菜籽
18、多酚与 Vc的混合物清除 O2-、OH 都不呈剂量- 效应关系。当总浓度为 0.25mg/mL 时，菜籽多酚与 Vc 的混合物没有协同增加清除的作用；菜籽多酚与 Vc 按 7: 3、8: 2 两种比例混合，在清除OH 时有协同增效作用，协同增效的最佳比例为 7:3，最大清除率达 78.78%。严奉伟等 20以过氧化值（POV ）与酸价（AV）为指标，采用Schaal 烘箱法研究菜籽多酚在菜籽油中的抗氧化效果，及其与 BHA 在菜籽油中的抗氧化协同增效作用。结果表明菜籽多酚在菜籽油中抗氧化与维持低酸价的最佳添加量为 0.02%。菜籽多酚与 BHA 在菜籽油中具有抗氧化协同增效作用，菜籽多酚与 B
19、HA 按 0.008%：0.012%使用时，菜籽油的 POV 与 AV 值达到最低。王莹 21实验研究证明：作为增效剂，有机酸、- 胡萝卜素等能够增强茶多酚的抗氧化性能；壳聚糖、食盐等能够增强茶多酚的抑菌活性，维生素类既能够增强茶多酚的抗氧化性能又能增强其抑菌作用。莫树平等 22以热带水果荔枝、龙眼、芒果为研究对象，选取叔丁基羟基茴香醚(BHA)、没食子酸丙酯(PG)、特丁基对苯二酚(TBHO) 、二丁基羟基甲苯 (BHT)及茶多酚等作为抗氧化剂，柠檬酸、苹果酸、磷酸、葡萄糖酸钙、EDTA 等作为抗氧化增效剂，进行单体和复合抗氧化青岛农业大学学士学位论文 香菇多糖抗氧化增效剂的研究4剂抗氧化试
20、验。得到各种增效剂均可明显增加 TBHQ 的抗氧化能力，不同增效剂对不同抗氧化剂的增效作用不同。综合比较，TBHQ 加入柠檬酸及 EDTA 增效后对荔枝、芒果原果汁的抗氧化效果理想，VC 保存率均达到 85%以上。李书国等 23以易氧化酸败的核桃油为试验原料，取等量的 9 组样品，将抗氧化剂TBHQ、PG、BHT、VE 及增效剂柠檬酸、抗坏血酸（V C）分别以不同的组合方式和配比添加到上述 9 组样品中，然后与空白样一起利用 Schall 烘箱法每隔 24 h 测一次过氧化值（POV） ，比较它们的氧化稳定性，得到最佳条件。张燕平等24从紫苏茎叶中提取抗氧化活性成分，并与茶多酚、维生素 E 比
21、较。实验得到在乙醇与碱水体积比为 8:2 混合提取时提取物达到最佳抗氧化效果，柠檬酸对其有很好的增效作用。初步鉴定其活性成分为酚类，黄酮类化合物。1.3 主要研究内容（1）香菇多糖、大豆多肽、大枣多糖、三七皂苷的抗氧化性质；（2）大豆多肽、大枣多糖、三七皂苷对香菇多糖的抗氧化增效作用；（3）最佳香菇抗氧化增效剂的配比。2 材料与方法 2.1 材料2.1.1 原料香菇、大豆粉、和田大枣，均购自青岛城阳大润发超市；三七，购自青岛城阳中药店。2.1.2 试剂木瓜蛋白酶 酶活 2000U/mg 杰辉生物技术有限公司纤维素酶 酶活 15U/mg 上海博奥生物科技有限公司无水乙醇 分析纯 天津市天力化学试
22、剂有限公司抗坏血酸（Vc） 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司盐酸 分析纯 莱阳康德化工有限公司冰乙酸 分析纯 莱阳康德化工有限公司高氯酸 分析纯 莱阳康德化工有限公司青岛农业大学学士学位论文 香菇多糖抗氧化增效剂的研究5DPPH（二苯代苦味酰基自由基）分析纯 美国 Sigma 公司铁氰化钾 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司邻二氮菲-亚铁 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司硫酸亚铁 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司双氧水 分析纯 洛阳市昊华化学试剂有限公司磷酸二氢钠 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司磷酸氢二钠 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司Tris 分析纯 瑞士 Roch
23、e 公司EDTA 分析纯 瑞士 Roche 公司邻苯三酚 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司二硫苏糖醇（DTT ） 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司三氯乙酸（TCA） 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司苯酚 分析纯 天津市天力化学试剂有限公司2.1.3 仪器2.2 方法2.2.1 多糖、多肽、皂苷等活性物质的提取及制备AR1140 电子分析天平 美国奥豪斯电子天平公司电热恒温水浴锅 龙口市先科仪器公司SHA-B 型恒温振荡器 常州国华电器有限公司UV-2000 紫外可见分光光度计 上海尤尼柯电器有限公司DU-800 紫外- 可见分光光度计 美国贝克曼库尔特有限公司FD-ID-80 冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司868 型 pH 计 上海奥立龙电器有限公司RE-6000 旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂SHZ-III 型循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂GBOF20CN1L-DG(WO)型微波炉 Galanz 有限公司TGL-16M 高速台式冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司
