1、1中蒙药制剂指纹图谱建立和辨认的方法和步骤杨永生 2009级研究生 学号：2009110100摘要 目的：介绍中蒙药制剂指纹图谱建立和辨认的方法和步骤，为祖国传统医药走向世界提供手段方法。方法：归纳国内近年关于指纹图谱的大量文献，分析其研究的方法，在中蒙药制剂质量控制中起到了重要作用。结果：中蒙药制剂指纹图谱技术进展很快 完全可以利用其作为中蒙药质量控制的手段。结论：中蒙药制剂指纹图谱的研究进展很快其科学的方法和步骤可以更好的提升中蒙药质量，中蒙药制剂指纹图谱技术一定可以加速祖国传统医药走向世界。 关键词 中蒙药制剂指纹图谱；方法和步骤中蒙药是我国人民在数千年治疗疾病过程中积累起来的宝贵财富，
2、中蒙药生产和质量的规范化和现代化是祖国传统医药走向世界的重要前提，目前中蒙药正处于迈向现代化的瓶颈阶段，中蒙药制剂指纹图谱的出现为解决这个问题提供了现代技术手段、中蒙药制剂指纹图谱近年来进展很快，本文综合了国内近年的有关文献对中蒙药制剂指纹图谱的建立和辨认的方法和步骤作一论述。1、中蒙药指纹图谱的定义、特点、分类1.1 定义：中蒙药指纹图谱是指某种（或某产地）中蒙药材或中成药经适当处理后，采用一定的分析手段,得到的能够标志该中蒙药材或中成药特征的色谱或光谱的图谱。利用色谱技术进行指纹图谱分析的中蒙药材因生长年限，生长环境的变化而可能产生个体间较为明显的差异，但个体间必然有群体共有的相似性 1。
3、1.2 特点：通过指纹图谱的特异性，能有效鉴别样品的真伪或产地；通过指纹图谱主要特征峰的含量或比例的制定，能有效控制样品的质量，确保质量的相对稳定。中蒙药指纹图谱有两个2基本属性 2：整体性和模糊性。1.3 分类：按应用对象来分类，可分为中蒙药材(原料药材)指纹图谱、中蒙药原料药(包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱、中蒙药中间体（工艺生产过程中间产物）指纹图谱和中蒙药制剂指纹图谱。按测定手段可分为：中蒙药化学指纹图谱和中蒙药生物指纹图谱。中蒙药化学指纹图谱系指采用色谱、光谱和其他分析方法建立的用以表征中蒙药化学成分的特征的指纹图谱；中蒙药生物指纹图谱包括中蒙药材DNA指纹图谱、中蒙药基因组学指纹图谱
4、及中蒙药蛋白组学指纹图谱。中蒙药基因组学图谱和中蒙药蛋白组学指纹图谱系指用中蒙药制剂作用于某特定细胞或动物后，引起的基因和蛋白的复杂的变化情况，这两种指纹图谱似可称为生物活性指纹图谱。此外还有扫描电镜（SEM）指纹图谱、计算机图象（CIA）指纹图谱等。2、 建立指纹图谱的方法 3见图1。中蒙药样品预处理(提取分离)测试样色谱分析(TLC、HPLC、GC、GCMS、LC一MS 等)色谱图（计算机图谱解析与处理)药效 对应关系 指纹特征指纹图谱质量稳定性评价质量稳定性评价结果方法学考察：重现性、稳定性、精密度。图1 指纹图谱建立方法示意图33、指纹图谱的分类 4 3.1 薄层色谱法（TLC）： 是
5、指将中蒙药材或中蒙药制剂的样品溶液点于特制的薄层板上，以适当的展开剂展开，取出晾干后，采取适当的显色后，建立的指纹图谱，然后比较图谱的相似性及差异；TLC最早应用于指纹图谱研究，具有快速、经济、可靠、操作简单、适用范围广、重现性好等优点，为国内外学者最快接受和广为使用。林明美 5等对柴胡10个品种近40个样品进行了薄层指纹分析。将柴胡根中的挥发油、乙烷提取物及甲醇提取物，分别进行薄层层析及薄层扫描。结果发现，皂苷d、a、c为柴胡属植物的特征性成分。不同品种的柴胡，来源区别显著者，其指纹图谱差异也显著，因此可根据图谱去推断药材的品种。颜玉贞6等用经过优化的系统在双槽展开箱中用硅胶薄层板作两次展开
6、，对黄连所含原小檗碱型生物碱进行薄层色谱分离，其荧光及紫外扫描图可作为黄连药材的指纹图谱，以此确定不同黄连样品中主要生物碱的分布。3.2 气相色谱法（GC）：系指利用气相色谱仪分离、测定中蒙药材及其制剂的样品溶液而得到的图谱。主要用于含挥发性成分的中蒙药材及其制剂的分析，该法具有高效、高灵敏度、样品用量少和分析速度快等优点。谢培山 7等建立了高良姜挥发油成分指纹图谱的研究方法，以鉴别高良姜的质量优劣。在中蒙药指纹图谱的研究中，更多地采用气相色谱一质谱(GCMS)联用的技术。李晓宁等利用色质联用仪产生的双线性数据，藉化学计量学发展的二维色谱质谱数据解析方法，对辽五味子果实挥发油、熟地黄石油醚酸性
7、提取物等进行了解析与鉴定。3.3 高效液相色谱法（HPLC）：是利用高效液相色谱仪分离、测定中蒙药材及其制剂的样品溶液而建立的指纹图谱以及一些鉴别参数。可根据被测样品中所含化学成分 的性质，选择合适的分离条件、检测器或采用联用技术、是目前应用最多的一种方法。中蒙药及其制剂的高效液相色谱分离，通常采用梯度洗脱程序，以便获得最佳分离效果，得到尽可能多的指纹信息。黄茂华 84等人采用反相高效液相色谱法建立了进口棕榈科麒麟血竭和国产百合科剑叶血竭HPLC指纹图谱，并运用相对保留指纹谱方法，发现进口血竭和国产百合科剑叶血竭的HPLC指纹图谱差异明显，而同一品种不同产地的国产血竭指纹图谱极为相似，但主成份
8、含量有一定差异。3.4 高效毛细管电泳（HPCE）：高效毛血管电泳法的分析对象几乎涉及了分析化学中的所有分析对象，从无机离子到高分子聚合物，从带电粒子到中性分子都能够进行分析。具有分离模式多、分离效率高、速度快、适用范围广、所需样品量少和试剂量少等优点，特别适用于水溶液样品如注射剂、汤剂的指纹图谱分析。3.5 高速逆流色谱法（HSCCC）：HSCCC是利用动态液-液分配原理分离样品，其分高度和重现性与HPLC类似，但样品前处理简单。3.6 红外光谱法（IR）：是指利用红外光谱仪分析、测定中蒙药材及其制剂而得到的光谱图。通过比较光谱中各吸收峰的位置及强度来鉴别中蒙药材及其制剂的真伪。IR是由分子
9、振动能级的跃迁产生的，反映了物质的结构信息，具有较强的特征性、重现性和稳定性。田进国 9 等分别用石油醚、乙醚、水提取灵芝、苦地丁、罂粟壳等30种药材对照品，测定其独特的红外光谱，加以鉴别。3.7 紫外光谱法（UV）：是将中蒙药材及其制剂的样品溶液进行紫外扫描而得到的光谱图。通过分析紫外光谱指纹图谱的峰位、峰形及强度，可以得到该样品一些化学信息。但该方法能提供的指纹信息有限，专属性较差，仅使用于中蒙药材的真伪鉴别，较少用于中蒙药制剂的质量控制。王秀坤 10等采用苦参提取液的紫外光谱数据，对40份苦参药材质量进行了化学模式识别研究，并同时结合红外光谱数据运用自适应共振理论网络(AR)模型进行了主
10、成分分析。3.8 核磁共振（NMR）：是指应用核磁共振光谱仪测定中蒙药材及其制剂样品所得到的光谱图。与红外光谱和紫外光谱相比较，5其信息量较大，重现性较好。但也不能反映该样品中组成物质的数量。因此，也仅多应用于中蒙药材及其制剂的真伪鉴定。3.9 质谱法（MS）：是指将中蒙药材或中蒙药制剂的样品溶液置于质谱仪中进行电于轰击电离，所获得供试液中化学成分的EI-MS图，不同中蒙药提取液所含成分不同，所得质谱图显示的分子、离子峰及进一步的裂解碎片峰亦不一致，可以作为鉴别中蒙药材及其制剂真伪的依据。袁湘林 11等利用一种新的质谱分析技术一基体辅助激光解吸电离时间飞行质谱对黄芪及其伪品进行研究，确定特征峰
11、，从而对真伪黄芪进行鉴别。3.10 X射线衍射法（X-ray）：是指利用X-射线衍射法测定中蒙药材及其制剂而得到的衍射图谱，是研究物质的物相和晶体结构的主要方法。X射线衍射法具有快速简便、图谱稳定可靠、指纹性强并能立即得知样品组分的特点。主要用于中蒙药材及其制剂的真伪鉴定。3.11 色谱联用技术：目前最常用的是高效液相谱（或毛细管电泳）/二极管阵列检测器/质谱/质谱联用方式（HPLC或CE/DAD/MS/MS)所得的多维指纹图谱。3.12 DNA指纹图谱：DNA指纹图谱多运用PCR技术从不同生物样品中人工合成DNA片段，这种DNA片段的大小、数目因生物不同而各异，因而称之为DNA指纹图谱。是运
12、用DNA分子标记技术及测序技术对中蒙药材及其原植物以及含原生药的中蒙药制剂进行真伪鉴别。如丁建弥 12等利用随机扩增多态DNA(1PD)技术，从经过形态鉴定的野山参和栽培人参药材中提取DNA模板，运用PD技术在电泳中产生条带，有效区别野山参与栽培人参，王义权等 13通过药材基因片段的DNA序列分析，可以准确地区分乌梢蛇及其混淆品，随着某一类药材及其伪、混品DNA序列数据的积累，能准确鉴别出的伪、混品原动、植物的种类也将增多，但技术难度大，鉴定成本较高。4、中蒙药制剂指纹图谱的建立步骤4.1 方案设计与思路64.1.1 研究对象的确定在调研有关文献、新药申报资料(质量部分和工艺部分)及其它研究结
13、果的基础上，尽可能的详尽地了解药材、中间体及成品中所含成分的种类及其理化性质，综合分析后找出成品中的药效成分或有效成分，作为成品和中间体指纹图谱的研究对象，即分析检测目标。例如，黄芪含黄酮、皂苷及多糖三类有效组分，黄芪多糖注射液及其中间体的指纹图谱则以多糖为研究对象，黄芪原药材的指纹图谱应把黄酮、皂苷及多糖作为研究对象。复方注射剂应根据君臣佐使的原则，以君药、臣药中的有效成分作为指纹图谱的研究对象，佐使药中的成分可采用其它指纹图谱方法进行辅助、补充研究。4.1.2 研究方法的选择研究方法应根据研究对象的物理化学性质来选择。大多数化合物可采用HPLC。例如黄芪中黄酮、皂苷、多糖等。挥发性成分应采
14、用GC。例如鱼腥草中的鱼腥草素、土木香中的土木香内酯、异土木香内酯和二氢土木香内酯等。某些有机酸经甲酯化后亦可用GC分析。采用上述方法难以分离检测的成分，可考虑使用TLC和CE。一个中蒙药制剂的指纹图谱可以同时采用多种方法进行研究。选择方法时，还需考虑药品检验系统复核时的设备、技术等因素。4.1.3 研究内容根据国家食品药品监督管理局中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)的规定，主要研究内容有原药材、中间体、注射剂的指纹图谱，涉及样品名称、来源、制备、测定方法、指纹图谱及技术参数等。4.2 样品的收集这是最初也是最关键的步骤。至少要收集10个批次样品。注意样品的代表性。74.2.1 切不可将
15、同一批次样品分散成数个批次，充当样品。4.2.2 原药材尽可能固定产地(GAP基地药材，地道药材)、采收期和炮制方法。对光线稳定，疗效稳定，无临床不良反应的药材批次应重点选择。 4.2.3 中间体、注射剂样品的收集应重点选择工艺稳定、疗效稳定、无不良反应的批次。4.2.4 留样应不少于实验用量的3倍。4.3 供试品溶液的制备(样品的预处理)4.3.1 药材供试液的制备根据所含成分的理化性质，通过溶剂提取、液液萃取、沉淀、吸附等方法，分离富集样品。例如，黄芪中黄酮类成分通过碱的萃取、皂苷类通过大孔吸附树脂吸附；苦参中总生物碱通过阳离子交换树脂分离；挥发性样品常用水蒸气蒸馏法制备。样品富集后，还需
16、通过氧化铝预柱、C18预柱、硅胶预柱、聚酰胺预柱等，除去色素等杂质，最后通过微孔滤膜，供HPLC测试。4.3.2 中间体供试液制备可针对有效成分处理，并参照原药材的制备方法。 4.3.3 注射剂供试液制备液体注射剂一般无需特殊处理，可直接分析检测。4.4 参照物的选择一般选取样品中容易获得且含量较高的一个主要活性成分或指标成分作为参照物（S）。参照物主要用于指纹图谱技术参数的确定，如特征峰(共有峰)的相对保留时间，峰面积比值等。并有助于图谱的稳定性、重现性的考查。例如三七药材的指纹图谱中以三七皂苷R1为参照物。由于指纹图谱比较复杂，内标物不易选择、插入，故一般不以内标物做为参照物。4.5 实验
17、方法和条件的选择其目的是通过比较实验，从中选取相对简便易行的方法和条8件，获取足以代表品种特征的指纹图谱，以满足指纹图谱的专属性、重现性和普遍适用性的要求。方法和条件须经过严格的方法学考察。例如稳定性试验，精密度试验，重现性试验等。注意事项：供试液的制备和色谱分析时均须定量操作，以保证图谱在整体特征上进行半定量(差异程度或相似程度)的比较。指纹图谱分析不同于含量测定，提高其分离度应以不牺牲色谱的整体特征为前提，故不应孤立地苛求分离度达到含量测定的要求。采用HPLC和GC制定指纹图谱，记录时间一般为1小时。(实测2小时)4.6 对照指纹图谱及其技术参数的建立4.6.1 测得的大量色谱数据需经分析
18、和数据处理，才能获得对照指纹图谱(拟合指纹图谱)及其技术参数，以此作为药品指纹图谱检验的依据。4.6.2 技术参数主要包括总峰面积、共有峰序号、参照峰(S)、共有峰相对保留时间(RRT)，共有峰峰面积比(RA)，非共峰面积等。RRT=RTi/RTs RA=Ai/As共有峰亦称特征峰（包括参照峰），系指所有被检批次中均含有的相同色谱峰，主要来源于样品中主要有效成分或指标成分。共有峰的化学归属，可采用对照品加入法或HPLC/DAD/MS/MS联用技术进行鉴别，后者可在无对照品的情况下使用。例复方丹参注射液指纹图谱应有9个特征峰相对保留时间分钟(峰序号)： 0145(1) 0186(2)0298(3
19、) 0378(4) 0425(5) 0499(6) 0594(7) 1000(s 原儿茶醛) 1145(8) 峰面积比值：0059(1) 0064(2) 0036(3) 0.11230(4) 0054(5)029725(6) 0055(7) 1000(s 原儿茶醛)0040(8)94.7 药材、中间体和注射剂指纹图谱的相关性注射剂中各特征峰均可在药材及中间体指纹图谱中得到追踪，中间体与注射剂的指纹图谱应非常接近，药材图谱中的色谱峰应比注射剂多。必要时可采用加入某一药材、有效部位或中间体的供试品，或制备某一药材、有效部位或中间体阴性供试品的方法，标定各指纹图谱之间的相关性。提供相关性研究的指纹图
20、谱。4.8 指纹图谱的评价中蒙药指纹图谱的评价系指将样品指纹图谱与建立起来的对照指纹图谱进行相似性比较，从而对药品质量进行评价和控制。中蒙药指纹图谱的评价不同于含量测定，它强调的是相似性(Similarity)，而不是相同性(Identity)，也即着重辨识完整图谱“面貌”，而不是求索细枝末节。分析比较的结果是对供试品与对照品之间的差异或一致性作出的评价。相似性的比较可以用“相似度”表达，相似度可借助国家药典委员会推荐的“中蒙药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件”计算，一般情况下相似度在 0910 之间即认为符合要求。5、中蒙药制剂指纹图谱辨认的方法和步骤指纹图谱的辨认还应注意指纹特征的整体性，
21、一个品种的指纹图谱是由各个具有指纹意义的峰组成的完整图谱构成，各有指纹意义的峰（或 TLC 斑点）其位置（保留时间或比移值） 、大小或高低（积分面积或峰高） 、各峰之间相对比例是指纹图谱的综合参数，辨认比较 时从整体的角度综合考虑，注意各有指纹意义的峰相互的依存关系。有的品种，特别是中蒙药复方制剂，必要时需两张以上的指纹图谱构成。指纹图谱的相似性从两个方面考虑，一是色谱的整体“面貌” ，即有指纹意义的峰的数目、峰的位置和顺序、各峰之间的大致比例等是否相似，以判断样品的真实性；二是样品与对照样品或“标准图谱”之间或不同批次样品指纹图谱之间总积分值作量化比较，应符合有关规定。指纹图谱相似度的判断也
22、可通过计算机指纹图谱相似度评价软件进行。6 、中蒙药指纹图谱的局限性 1410虽然中蒙药指纹图谱在实现中蒙药物质群体整体性控制方面具有一定的优势，但应用于中蒙药质量控制还存在一定局限性：6.1 指纹图谱与药理作用的相关性别 中蒙药指纹图谱质量控制方法是采用被认定合格的产品或原料的指纹图谱作为比对标准，采用多指标比对的方法控制中蒙药质量。所以，中蒙药指纹图谱质量控制方法是比较完整的控制中蒙药的物质群体。然而，指纹图谱与药理作用之间的相关性仍然是模糊的，无法从指纹图谱中解析某一峰或者某一段峰所代表的药理作用。6.2 指纹图谱与化学成分的相关性别 中蒙药指纹图谱质量控制方法的局限性还表现在指纹图谱与
23、化学成分之间缺乏相关性，这主要是由于指纹图谱中色谱峰纯度不够所致。采用色谱分析方法获得的指纹图谱通常将未达到基线分离的色谱峰作为特征组分峰，因此无法检验这些峰的纯度，无法排除不同组分对同一峰的干扰，也不能确定某一组对该峰的贡献。换言之，当色谱的纯度受到质疑时，这些特征组分峰与化学成分的对应关系是不确定的。不同的指纹图谱可以表示样品之间的差异，但是相同的指纹图谱并不一定代表彼此具有相同的化学成分，样品的指纹图谱与标准指纹图谱相符并不一定表示样品与标准相符。6.3 指纹图谱与实验条件的一致性别 中蒙药指纹图谱质量控制方法采用标准指纹图谱作为对比标准，因此可以省去用对照品和做对照实验，这时候中蒙药指
24、纹图谱质量控制方法的优点。但是，缺少对照品和对照实验却无法保证获得标准指纹图谱实验条件与测定样品的实验条件的一致性。因此，建立在化学成分模糊不清基础之上的中蒙药指纹铺谱质量控制方法只能是一种过渡性的“黑箱”质量控制手段 15。7、前景展望 目前，中蒙药制剂已全面建立相应的指纹图谱质量控制体系，我们相信在不久的将来，指纹图谱技术将会应用于所有剂型的中蒙药制剂，全面替代目前以单一成分指标控制制剂质量的模式，并在指导制剂工艺的改革、药材中间体成品的质量控制、贮11藏条件的选择、中蒙药新药研究等方面发挥更大的作用。指纹图谱技术的发展，必定为中蒙药制剂的研究开发带来更美好的明天。【参考文献】1 谢培山.
25、中药色谱指纹图谱鉴别的概念、属性、技术与应用.中国 中药杂志, 2001,26(10):653.2 蔡宝昌,潘杨,殷武.指纹图谱在中药研究中的应用.世界科学技术 中药现代化,2000,2(5):10.3 杨桂芳，王鹏.中药指纹图谱大的建立方法和作用J.时珍国医国药，2004，15（1）：21.4 王强，罗集鹏.中药分析M，中国医药科技出版社，2005，643646.5l 林明美，罗燕.柴胡的薄层指纹分析J.药物分析杂志，1987,7(1)13.6 颜玉贞，林巧玲，谢培山中国中药杂志，1993，18(6)：329.7 黄茂华等棕榈科麒麟血竭和国产百合科剑叶血竭 HPLC 指纹图谱分 析与比较上海
26、大学学报(自然科学版)，2001，7(4)：326330.8 谢培山指纹图谱分析一综合的、可量化的中药质量评价手段中国医药情报，2002，8(1)：17-20.9 田进国，娄红祥，任健中国药科大学学报J，1996，27(1)：24.10 王秀坤，李家实，魏璐雪，等中国中药杂志，1996，21(4)：198.11 袁湘林，张玉奎，邹汉法药物分析杂志，2001，21(1)：7.12 丁建弥，万树文，梅其春，等用随机扩增多态 DNA(RAPD)技术鉴定野山人参中成药，2001，23(1)：3-5 27.13 王义权等基因片段序列分析及其演化关系动物学报 45(3)：332338.14 姜秋风. 中药指纹图谱,青海医药杂志，2005，35（9）：5758.1215 王少坤，燕兰英.中药指纹图谱应用于中药质量控制的局限性，药学进展，2001，25（6）：352.13
