1、1第六章 pH、温度、抑制剂和活化剂对酶反应速度的影响6.1 pH 对酶反应速度的影响6.1.1 酶反应的最适 pH如果在不同 pH 条件下测定酶反应速度，可得到左图中的曲线 A,最适 pH 为 6.8。如果将酶在不同 pH 条件下预保温，然后在pH6.8 下测酶反应速度，得到曲线 B，说明 pH58（除了 pH6.8 附近）使酶可逆失活，当 pH回到 6.8 时，酶活性可完全恢复；当 pH 8 或 pH5 时，酶发生了不可逆失活。一些酶的最适 pH 和等电点注意最适 pH 与等电点的差别。与等电点相比，最适 pH 偏酸的说明要在带正电荷的情况下工作，最适 pH 偏碱的说明要在带负电荷的情况下
2、工作。6.1.2 最适 pH 的解释酶 底物 等电点 最适反应 pH淀粉酶（猪胰） 淀粉 5.25.6 6.9淀粉酶（麦芽） 淀粉 6.0 5.2蔗糖酶 蔗糖 5.0 4.5乙酰胆碱酯酶 乙酰胆碱 5.0 8.4核糖核酸酶（牛胰） 核糖核酸 7.8 7.8胃蛋白酶 各种蛋白质 3.8 1.52.5胰蛋白酶 各种蛋白质 7.8 7.5胰凝乳蛋白酶 各种蛋白质 8.18.6 89木瓜蛋白酶 各种蛋白质 9.0 5.05.5菠萝蛋白酶 各种蛋白质 9.510.0 6.06.5脲酶 尿素 5.05.1 6.47.6脱羧酶（酵母） 丙酮酸 5.1 6.0过氧化氢酶（也叫触酶，牛肝） H2O2 5.6 5
3、.7醛缩酶（兔肌） 果糖二磷酸 6.0 7.58.5己糖激酶（酵母） 葡萄糖，ATP 4.54.8 89黄嘌呤氧化酶（牛乳） 黄嘌呤 6.7 8.59.02酶分子中含有多种可解离的基团，如COOH、NH 2、SH、OH 、咪唑基、胍基等。在最适 pH 时，各基团的解离状态处于使构象正常及活性中心处于结合底物和催化反应的最佳状态。当 pH 偏离最适 pH 时，活性中心基团的解离状态发生变化，使酶与底物的结合能力（亲和力）下降，催化能力也下降，致使酶活性下降，即保持正确解离状态的酶分子比例下降。若pH 偏离得太多，导致构象发生不可逆变化，就会使酶变性失活。如溶菌酶活性中心的两个氨基酸只有处于 As
4、p52COO 和 Glu35COOH 状态下才具有活性。底物的解离状态也受 pH 的影响，从而影响到底物与酶的结合及被催化反应。6.1.3 酶的酸碱稳定性一般来说，酶反应的最适 pH 也是使酶最稳定的 pH，偏离的 pH 会使酶分子的构象发生变化，构象变化的程度与 pH 偏离的程度及偏离 pH 处理的时间有关。若 pH 偏离不多，或处理时间较短，回复到最稳定 pH 后，酶活性可得到恢复，这种恢复也是随着时间的推移逐渐发生的。若 pH 偏离较多或处理的时间较长，则酶发生不可逆失活。6.1.4 pH 影响酶反应速度的动力学下面讨论几种不同的解离体系的动力学，并假定在实验涉及到的 pH 范围内，酶的
5、构象不发生变化。6.1.4.1 游离酶和 ES 复合物二者的解离体系A解离模式假定各可逆过程均迅速达到平衡，ESHEHP 为限速反应。B速度方程的推导用迅速平衡法处理：12eKEH2e12esKSEH32esKEHSs由得 ； 由得 ；2EHSEse EHSKs由得 ； 由得 ；12Kes 2Ses由得 ；12EHSSEes V = k2EHS， E0 = E EH EH 2+ES EHSEH 2+S， 220 SEHESEk将式代入上式得 )1( 21202 SKSKHSHKkVesesesse 分子分母同乘以S得 )1()1( 220HSKEkVeses分子分母同除以 得21KHes411
6、2202 SKVSHKSKEkVHmeesss式中 k2 E0 = Vm 。将上式取双倒数形式得)1()1( 22 HKVSeses mC讨论H+既影响 VmH+，又影响 KmH+。当H + 很高或很低时，式子可简化，得 KmH+ 的简化式，但意义不大。D作图法求常数a斜率及截距的再作图法：当 Ke1100 Ke2，K es1100 Kes2 时，可用本法求 Ke1、 Ke2、K es1、K es2、K s、V m 等常数。式中的斜率和截距整理得斜率 mmmVHKVseses1 21 截距 HKeses21根据式，在不同的 pH 下作直线，每一个 pH 可以得到一个斜率和一个截距。当H +较高
7、时，上面两式中的 项可以忽略不计，剩下的部分为直线方程。以斜率对HH+作图得左上图，以截距对H +作图得右上图。当H +很低时，上面两式中的H +项可以忽略不计，以斜率对 作图得左下图，以截距1H5对 作图得右下图。1H从这 4 个图中，可得出各个常数。但如果 Ke1 和 Ke2 相近，或 Kes1 和 Kes2 相近，或 pH居中，则不能忽略任何一项。bDixon-Webb 对数作图法此方法要求 pKe1 和 pKe2 及 pKes1 和 pKes2 的差距3.5 个 pH 单位。以 对 pH 作图HmVlg可求得 pKes1 和 pKes2，以 对 pH 作图可求得 pKe1 和 pKe2
8、 。HmKVlg根据式， ，21esHm )(lglg21HKVesmH当处于低 pH 条件时，H +很大， 可以忽略不计，因 很大，1 也可以省略，故2Kes es上式可写成， ，1lglgesKHVmH 1lglgl esKHVmH61lgl espKHVmH以 对 pH 作图，得一直线，直线的斜率为 1。在高 pH 时，H +很小， 和 1 都可以忽略不计，上式可写成es， lglg2HKVmH，lll 2esmpmHg以 Vl对 pH 作图得一直线，直线的斜率为 1。在最适 pH 下，V mH+达到最大，VmH+V m， 。mVlgl以 lg对 pH 作图得一水平直线，水平直线与斜率为
9、 1 的直线的交点的横坐标为pKes1，水平直线与斜率为1 的直线的交点的横坐标为 pKes2 。根据式， HmKV1122HKkVesseseem 1 2HKVesm当处于低 pH 时，H +很大，1 和 可以忽略不计，故上式可写成2e， ，HmKV1es lgllgl 1HKVKesmHpKesm1lgl7以 对 pH 作图得一直线，斜率为 1。HmKVlg在高 pH 时，H +很小，1 和 可以忽略不计，故上式可写成1eKH， ，HmKV2es 2lgllgl esKHKVmH2lgl espm以 对 pH 作图得一直线，斜率为 1。HmKVl在最适 pH 下， VmH+V m， K m
10、H+= Ks（K sK m） ， ，HVsKm， 以 对 pH 作图，得一水平直线。此水平直线与斜率为 1 的HmKlglsHmlg直线的交点的横坐标为 pKe1，此水平直线与斜率为1 的直线的交点横坐标为 pKe2。此图与上图相似。6.1.4.2 游离酶的解离体系A 解离模式B速度方程， ；sKEHS EHSKs， ；2e 22ESsee， ；12eKEH 112 HKEHeseE0 = E + EH + EH2+ + EHS， V = K2 EHS 。根据上述式子得8， 。)1(2SHKVesm )1(2HKKesHmC讨论apH 只影响 Km 值，而不影响 Vm 。当S K mH+时，V
11、 = V m 。b在低 pH 下，H +很大，式中的 可以忽略不计，于是2e，此式与竞争性抑制作用的速度方程相似，因此在低 pH 范围内，)1(SKHVesmH+是一种竞争性抑制剂。 竞争性抑制作用也是只改变 Km ，不改变 Vm 。c随着H +的变化，K mH+可达一极小值。将 KmH+表达式对H +微分得)1(2desm 22111 HdKdeeees21Hes，当 时，K mH+为极小值。21KdesHm 0dHm， ， ，012e 21e 21eK， 。)lgl(lg21eH )(12epp当 KmH+为极小值时，V 最大，上式的 pH 为最适 pH 。D作图法求常数与前一种体系的方法
12、相似，按 KmH+的表达式 作图。6.1.4.3 酶 底物复合物的解离体系9A 解离模式 B速度方程（推导过程略）或 1221SHKVesesm )1(2HKSKVessmC讨论a H+既影响 VmH+，又影响 KmH+ 。b当H +很大时，式中的 可以忽略不计，速度方程可写成2es，此式与反竞争性作用的速度方程相似，这时H +起着反竞争)1(essKHSVm性抑制剂的作用。D作图法求常数按第一种体系的方法作图求常数。6.2 温度对酶反应速度的影响化学反应以分子运动为基础，分子的动能与温度的高低直接相关，所以温度的变化会影响酶反应速度。6.2.1 酶反应的最适温度在不同温度下测酶反应速度，可得
13、出最适温度。但最适温度不是酶的特征常数，当温度升高时，除了 V 提高外，酶失活的速度也加快。所以短时间测定时，最适温度较高，长时间测定时，最适温度较低。6.2.2 酶的热稳定性大多数蛋白质在 5070出现可逆变性（但也与处理时间有关） ，7080出现不可逆变10性。酶的耐热性质有遗传上的差异。RNase 耐高温（100 ） 。可逆变性和不可逆变性是各种次级键被破坏的程度决定的。酶的冷失活可能是亚基间的解聚或错位引起的。6.2.3 升温使酶反应速度增加酶反应与非酶反应相比，能降低活化能 Ea 。根据 Arrhenius 公式，化学反应速度常数与温度的关系可表示为：，式中 A 为频率因子，它表示单
14、位时间单位体积内分子的碰撞次数；Ea 为活RTEaek化能；k 为反应速度常数。对 Arrhenius 公式两边取对数得： ， ，eRTEaAklnlnRTEaAkln30.2lg在温度 T1 时， ； 在温度 T2 时， ；11.lgEaAk 2230.lgak下式减上式得 2112 30l Ra， 式中的 R = 8.314 J/mol/K 。211230.)(lgTREak根据此式，若已知一个温度下的反应速度常数及活化能 Ea，就可以求另一温度下的反应速度常数。若 T2 比 T1 高 10，则 称为 Q10（温度系数） 。Q 10 大说明温度对酶反应速度的影响12k大，Q 10 小说明温
15、度对酶反应速度的影响小。对于恒温动物来说，大部分酶的 Q10 约为 2。6.2.4 根据温度效应求热力学常数A求活化能（Arrhenius 作图法）， ， ，0EkVm0Vm0lglgEVkm11 ， ，RTEaAk30.2lg0lgEVmRTaA30.2lmV1.在不同温度下测（同一酶量的）V m，以 对 作图，得一直线，直线的斜率lT1，Ea2.3038.314斜率。REa30.2若是复合的反应过程，直线可能会变折线，这说明限速步骤在转折点发生了改变，不同的线段代表了不同的限速步骤，各自有不同的 Ea。图 C 中左侧的正斜率线段是温度太高酶变性所致。B求解离基团的标准焓（Vant Hoff
16、 作图法）根据 Vant Hoff 公式： ，式中 K 为基团的解离常数。2lnRTHd， 积分此式得 TRHKd21ln dTRHd21ln， ， d2l CTK1ln CRK130.lg， 。CTRHK130.lg RHp30.2测不同温度下某基团的解离常数 K，按上式以 pK 对 作图，得一直线，直线的斜率为T1， 2.3038.314斜率。30.2126.3 酶的抑制作用和抑制作用动力学由于某种物质与酶相互作用使酶活性下降叫酶的抑制作用，这种物质就是抑制剂。而由其他因素如加热造成的酶活性下降或丧失叫钝化作用。6.3.1 酶活性抑制的两大类型A可逆抑制作用（reversible inhi
17、bition）抑制剂与酶以非共价键结合，用透析、超滤或凝胶过滤等方法可以除去抑制剂，恢复酶活性。B不可逆抑制作用（irreversible inhibition）抑制剂与酶以共价键结合，用上述物理方法不能除去抑制剂和恢复酶活性。不可逆抑制剂分为专一性和非专一性两类。专一性不可逆抑制剂仅和活性中心的基团反应，非专一性不可逆抑制剂可以和酶分子各部位的基团反应，甚至可以和几种不同的基团反应。6.3.2 可逆和不可逆抑制作用的判断除了用物理方法可除去抑制剂恢复酶活性的鉴别方法外，还可以用动力学方法鉴别。A定量的抑制剂与一定量的酶溶液一起预保温，隔一段时间后，从中取出不同量的酶 抑制剂混合液，测其最大反
18、应速度 Vm，用 Vm 对所取混合液量作图。图中曲线 1 为对照。曲线 2 为不可逆抑制剂，因有一部分酶被抑制了，所以有活性的酶浓度下降，直线的斜率下降。曲线 3为可逆抑制剂，取少量混合液时，在反应体积一定的条件下，混合液的稀释程度较大，酶被抑制的比例减少，相对活性较高；取较多混合液时，混合液的稀释程度较小，酶被抑制的比例较高，相对活性较低。B在反应系统中加入一定量的抑制剂，然后加不同的酶量测最大反应速度 Vm。以 Vm 对酶量作图。图中曲线 1 为对照。曲线 2 为不可逆抑制剂，当酶量超过不可逆抑制剂的当量时，才开始出现酶活性，以后增加的酶不受不可逆抑制剂的影响，保持与对照相同的斜率。曲线
19、3 为可逆抑制剂。13， ， EIKi0EI，0EIKi， ， ，0KIii 0KIii0EKIii0IEi无抑制剂时， ； 有抑制剂时， 。0kVcatm 0EIKkEVicatcatm由于在有抑制剂时， 小于 1，所以 Vm 对酶量（ E0）作图时，得一斜率较小的直IKi线。6.3.3 不可逆抑制作用6.3.3.1 非专一性不可逆抑制剂的作用下列几类试剂能够和酶蛋白中的一些侧链基团反应，形成共价修饰物：酰化剂、烷化剂、含有活泼双键的试剂、亲电子试剂、氧化剂、还原剂等。常见的非专一性不可逆抑制剂及被它们修饰的基团见下表：（表略）非专一性不可逆抑制剂能与活性中心内外的基团反应，利用邹承鲁提出的
20、尝试作图法，可以判断出（某种）必需基团的数目：在测定不可逆抑制剂作用过程中酶活性的剩余分数 的同a时，测定被修饰基团的剩余分数 ，根据 ，按 1，2，3，分别以 对 作图，xxai1i i1x成直线关系的 值即是必需的该种基团的数目。i6.3.3.2 专一性的不可逆抑制剂的作用专一性的不可逆抑制剂分为 Ks 型和 Kcat 型两类。AKs 型不可逆抑制剂此类抑制剂与底物结构相似，能与酶的底物结合部位结合，同时此类抑制剂上带有一个活14性基团，可以和附近的相应基团反应，形成共价键。它们有结合专一性，但没有反应专一性，即也能与活性中心以外的基团反应。如果抑制剂与活性中心结合的亲和力大，与活性中心外
21、结合的亲和力小，解离常数相差三个数量级以上，这时可以忽略对活性中心以外基团的修饰，有较大的应用价值。修饰是否发生在活性中心，可用以下三种方法判断：a 修饰程度与酶活性的下降是化学计量的，完全修饰后酶活性完全丧失。b 底物、竞争性抑制剂有保护作用。c 采用简便的方法使酶发生可逆失活，失活后不被修饰。下结论时要综合分析，有时三个条件都满足了，仍有结论错误的可能。BKcat 型不可逆抑制剂此类抑制剂既能与活性中心结合，又能被活性中心催化反应，反应后在抑制剂分子上产生活性基团，此活性基团再与活性中心的必需基团反应，产生共价修饰。这类抑制剂的专一性很高，有人称之为自杀性底物。6.3.4 可逆抑制作用动力
22、学可逆抑制分为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合型抑制几种类型。6.3.4.1 竞争性抑制作用（competitive inhibition）A竞争性抑制模式B动力学方程推导a快速平衡法： ESK， S；， ；EIKi ESKIIEIiiS15，0EISESESKIi，0 1KiSS )1(IiS， ，)(0 EIEiS )1(0SKIEiS， 。kVp )1(0SKIkiSp)(IViSmVmb稳态法：有 3 种酶存在形式（E、ES 、EI ） ，就要写出两个微商等于零的方程式。0 1111 IEkSEIkSEktd iip011 tSp由式得 ， ，11ESkEkp )(11ES
23、kSkp 1Sp Km由得 ，)()( 111EIkSEIkk iip ，)11SEI pii，1()(iikIk将式代入得 ，111 )()( iikESkESISEI pp16111111 )()( iiii kESIkESkESIESkEI pppp= 1SkIpi SKImi， 将两式代入得0ESIEVp0 ESKIkmmpi= ，10SIKEkVmpi IVmi 。)(IiS SKmcKing-Altman 法：，)()( 1110 SkkIkSES iii pp 17，)()( 1110SkkIkSEES iii ppi ，)()( 1110IkV iii ppip ，111 )(
24、)(ippmkSkISVii ，)(111 SkIkVpipm SKIVmi)(SKIVimVmC讨论a 竞争性抑制作用不改变最大反应速度，而是改变 Km （表观 Km） ， I越大则 Km 越大。b 一个竞争性抑制剂对酶反应速度的抑制程度，当S 固定时随着I的增加而加大，当I固定时随着S的增加而减小。c 当S固定时，达到两种抑制分数所需的 I浓度比为一常数，如 ， 。81.09I21.07ID竞争性抑制作图法a 双倒数作图法：在固定I时， 对 作图可得一直线，其纵轴截距为 ，横轴截距为V1SmV；随着I的增大，直线的斜率增大，表观 Km 值 Km也增大，但最大反应速度 Vm 不mK118变。
25、 = 。mmVSKIVi1)1(mS1bHanes-Woolf 作图法：将双倒数式两边同乘以S 得= ，mmVKISVi)1(mVS在不同的I 浓度下，直线的斜率不变，纵轴截距随I 的增大而增大，出现一组平行线。E求竞争性抑制作用中的 Ki 值a 双倒数式的斜率对I再作图：根据双倒数方程 ，在不同I下作多条直线，得到多个斜率。mmVSIVi1)1(斜率 ， 斜率 。)1(iKImmKIi以双倒数图的斜率对I作图，可得一直线，直线的横轴截距为 。ib Km 对I 的再作图：19在不同的I 下求得相应的 Km 值，Km ， Km ，)1(iImIi以 Km 对I 作图，可得一直线，直线的横轴截距为
26、 。iK横轴截距的求法： 0， ， mIKi mmIiiKIcDixon 法求 Ki 值：将双倒数方程改写成 随I浓度变化的方程V1， ，mmSIVi)(1 mmVISKVi11)1(KVIKi在一个固定的S下，改变I测得相应的 V，以 对I 作图可得一条直线，两个S 所得的两条1直线的交点的横坐标为 ，纵坐标为 。多个S所得的多条直线同样交于这一点。证明如im下：当在两个S下得到的两条直线的纵坐标 相等时，有V1= ，)1(1SKVISKVmmi )1(22SKImi 20，1221 1 SKISKISmmmii ，1221 )(Iii， （交点横坐标） 。2121SISKi iKI将 代入
27、得 ，iI )1()(SVKVmmii ， （交点纵坐标） 。11SSVm m在 Dixon 作图中，直线的斜率 ，在不同的S下可以得到不同的斜率，以斜率1SKVim对 作图，可得一通过原点的直线，这充分证明抑制剂为竞争性的。因为混合型抑制也能得1S到如图“竞争性抑制双倒数图的斜率对I的再作图”中的直线，但得不到“竞争性抑制 Dixon 作图斜率对 的再作图”中的直线。混1S合型抑制的图是 6.3.4.2 非竞争性抑制作用（non-competitive inhibition）A非竞争性抑制模式S 和 I 各自独立地与酶结合，互不影响，只有 ES 能分解出产物。并且 Ks = Ks，Ki =
28、Ki。B动力学方程21=1SKIVmiSmC讨论在非竞争性抑制作用中，I 只影响 Vm，使之下降，但不影响 Km 。在个别酶反应中，ESI 也能分解出产物，但速度较慢。在过量 I 和一定底物浓度下测酶反应速度，若 ESI 不能分解出产物，随着I的增加，V 趋向于零；若 ESI 可以分解出产物随着I的增加，V 趋向于一定值。设残留活性分数为 a，则= ， 此式说明 a 与S 无关，并且 Ki 等1SKVSIammiiiKI1Ii于残留 50%酶活性时的I。若以抑制 x % 酶活性所需的 I 浓度为 Ix ，则， 。81.09I21.07ID非竞争性抑制作图法a双倒数法作图： ， 式中 。mVSK
29、 iKIVm1在固定I 时， 对 作图可得一直线。直线的纵V1轴截距随I 变化，等于 ，I 越大， 越小；直线的mmV22横轴截距不变，为 。mK1bHanes-Woolf 作图法： mVKS横轴截距为 。mE求非竞争性抑制作用中的 Ki 值a双倒数式的斜率对I再作图：斜率 ， 直线的横轴截距为 。)1(iKIVmmmVKIi iKb双倒数式的截距对I再作图： ， 直线的横轴截距为 。)1(iKIVm mmVIi1 iKcDixon 作图法：由双倒数方程 ，)1()1(ii ISImm，1 IKVIKVSiim )1()(SImi 以 对I 作图，直线的横轴截距为 。V1i23此 Dixon
30、直线的斜率 ， 斜率 ，)1(SKVmiiiKVSmm1以斜率对 再作图，得一纵轴截距为 的直线，这与竞争性抑制作用不同，后者的1Sim直线通过原点。6.3.4.3 反竞争性抑制作用（uncompetition inhibition）A反竞争性抑制模式在反竞争性抑制作用中，I 只与 ES 结合，只有 ES 能分解出产物。由于 I 的存在促进了 E和 S 的结合，所以称为反竞争性抑制。B动力学方程=1SKIIViimmC讨论反竞争性抑制既降低 Vm（成为 Vm） ，也降低 Km（成为 Km） 。在I一定时，随着S的增加，抑制分数也增加。证明如下：= 11Vaii )1(SKISmi)1(iKIS
31、m24 。)1(iiKISSKmmSKIiimiiKIm1D反竞争性抑制作图法a双倒数作图法： ，在不同的I下，可得一组平行直线。)1(iIVSmbHanes-Woolf 作图法：=)1(iKIVSm mmVKSIi)1(E求反竞争性抑制作用中的 Ki 值a双倒数方程纵轴截距的再作图：纵轴截距 ，作直线图的横轴截距为 。)1(iKIVmmmVIi1 iKb双倒数方程横轴截距的再作图：先将横轴截距取相反数（取正值） 。横轴截距 ，作直线图的横轴截距为 。)1(iKImmmKIi1 iK25cDixon 作图法：，当S 无穷大时，横轴截距为 。)1(1SKVIVmmi iK6.3.4.4 混合型抑
32、制作用（mixed-type inhibition）A混合型抑制模式与非竞争性抑制相比，混合型抑制的 不等于 1，而非竞争性抑制的 等于 1。B动力学方程 11SKISIKkViiiiSpmC讨论a混合型抑制剂既影响 Vm（使之下降） ，又影响 Km（使之上升或下降，取决于 的大小。当1 时，K m 升高；当 1（即 ）时，不同I 下作出的这些直线的交点位于第二象限，交点坐标为（iK） 。当 01 时，交点位于第二象限；当 0ATP4 0 ，舍去；所以 0.9910 5 mol/L 10 5 mol/L。1x 2MgATPb在双倒数图中，随着S 0 的增加， 对 成直线，到S 0A 0 时，图
33、形开始弯曲；当SV10S0 A0 时，图形呈水平线，该线的延长线与纵轴的交点为。当S 0 和A 0 都很高时，可得出 和 。mV1m1SAK6.5 酶与配体解离平衡常数的测定6.5.1 平衡透析法由一片半透膜将一个小室隔成两半，半透膜仅允许配体透过而不允许酶透过。在膜的一侧加酶和配体，另一侧仅加配体，配体是同位素标记的。经过一段时间平衡后，测定膜两侧的配体浓度（可用液体闪烁计数仪测定） ，可计算出解离平衡常数。设加酶和配体一侧测得的配体浓度为 ，仅加配体一侧测得的配x体浓度为 ，加的酶浓度为 ，则y0E， 式中 为与酶结合的配体浓度 。IKSyx)(yxEI在小室体积仅 20l，取 3 份样品，每份样品 5l 就可以测定。该装置至少需要平衡 12小时，所以不能用于不稳定的酶和配体。6.5.2 过滤分析法许多蛋白质（与任何一种缓慢解离的结合配体一起）可以结合在硝酸纤维素滤膜上，而游离配体不会被阻滞。分别测定滤膜上和滤液中配体的量，同上式可以计算出 Ks 。6.5.3 凝胶过滤平衡酶和配体的分子量一般差别较大，用凝胶过滤层析的方法可使二者分开。先用含一定浓度的配体溶液（平衡溶液，也是加样溶液和洗脱溶液）平衡柱中层析介质（如Sephadex） ，将加有酶的样品上样，再用洗脱溶液洗脱，可得
