1、项目名称： 恶性肿瘤非编码 RNA 相关蛋白的功能网络与调控机制的研究首席科学家： 宋尔卫 中山大学起止年限： 2010 年 1 月-2014 年 8 月依托部门： 教育部一、研究内容本项目拟解决的关键科学问题是“恶性肿瘤非编码 RNA 相关蛋白的功能网络和调控机制及其与肿瘤发生发展和治疗抗性的关系”，包括以下四个方面： 1）新的肿瘤 ncRNA 及相关蛋白的发现和作用机制；2）肿 瘤 ncRNA 转录、转运、加工及修饰过程中相关蛋白的功能；3）ncRNA 相关蛋白在 肿瘤发生发展中的作用；4）ncRNA 相关蛋白与肿瘤治疗抗性的关系。围绕上述科学问题，本项目拟以我国常见的恶性肿瘤为疾病模型，
2、研究肿瘤细胞内相关蛋白网络如何参与 ncRNA 的生物合成与基因调控功能，并探索它 们之间的相互作用对肿瘤细胞生物学行为的影响，以及与肿瘤发生发展和治疗抗性的关系。主要研究内容包括：1）建立和优化适合于肿瘤研究的 ncRNA 组学方法和 ncRNA 相关蛋白研究体系， 筛选和鉴定一批新的 肿瘤相关 ncRNA 及其相互作用蛋白；2）探索 DNA 甲基化和组蛋白修饰及转录 因子对肿瘤 ncRNA 的转录调控，以及相关蛋白在 ncRNA 转运、加工及修饰过程中的作用；3）探讨ncRNA 及其相关蛋白对肿瘤启动细胞自我增殖、分化方向和成瘤特性的 调控机制，阐明其与肿瘤发生的关系。研究 ncRNA 及
3、其相关蛋白在肿瘤发展过程中对肿瘤细胞 EMT，肿瘤转移和血管生成的作用； 4）研究 ncRNA 及其相关蛋白调控肿瘤细胞凋亡、自噬的机制，解析常见恶性肿瘤中 ncRNA 及其相关蛋白对治疗抗性的影响。二、预期目标本项目的总体目标以常见的恶性肿瘤为模型，通过研究非编码 RNA（ncRNA）相关蛋白的功能网络和调控机制，发现一批新的肿瘤 ncRNA 及相关蛋白并揭示其作用机制； 阐明肿瘤 ncRNA 转录、 转运、加工及修饰过程中相关蛋白的功能；解析 ncRNA 相关蛋白在肿瘤发生发展中的作用以及 ncRNA 相关蛋白与肿瘤治疗抗性的关系，使我国在恶性肿瘤 ncRNA 相关蛋白研究领域取得突破性进
4、展， 为我国在该领域培养一批优秀人才。 本项目的五年预期目标1建立适合于肿瘤研究的 ncRNA 相关蛋白的各种平台，包括适合于 肿瘤研究的 ncRNA 组学技术平台， 肿瘤特异 ncRNA 相互作用蛋白质高通量筛选和分析技术平台；建立计算生物学和实验生物学有机结合的研究方法，系统分析和鉴定一批新的不同长度和不同类型肿瘤特异性 ncRNA 及相关蛋白，揭示 ncRNA及相关蛋白的相互作用机制。2发现 30-40 个新的参与恶性肿瘤功能网络调节的 ncRNA 相关蛋白，包括参与肿瘤 ncRNA 基因的 DNA 甲基化、组蛋白修饰和转录，以及肿瘤 ncRNA 转运、加工及成熟修饰的相关蛋白；调节肿瘤
5、启动细胞自我增殖、多向分化，成瘤能力等生物学特性的 ncRNA 相关蛋白；调节肿瘤细胞 EMT 和抗凋亡特性，以及肿瘤转移、血管生成和治疗抗性的 ncRNA 相关蛋白，为阐明恶性肿瘤 ncRNA 相关蛋白功能网络和调控机制提供新线索。3. 阐明 ncRNA 相关蛋白在肿瘤发生发展和治疗抗性中的新的调控机制，包括肿瘤特异 ncRNA 相关蛋白的表观遗传调控机制，ncRNA 相关蛋白对肿瘤启动细胞的调控机制，ncRNA 相关蛋白对对肿瘤血管生成、以及肿瘤细胞迁移和 EMT 的调控机制，ncRNA 相关蛋白对肿瘤细胞凋亡、自噬和治疗抗性的调控机制，深入研究 10-20 种左右具有临床意义的非编码 R
6、NA 及相关蛋白，发现至少 23 条新的 ncRNA 相关蛋白参与的调控肿瘤发生发展和治疗抗性的信号转导通路，为人类认识肿瘤发生发展的分子机制和治疗癌症提供理论依据。4预计在 SCI 收录杂志发表论文 80 篇以上，其中 IF5 分以上论文超过 40篇，争取在 Cell、Nature、Science等顶尖杂志上发表高水平论文，申请专利 10-15个。5为我国在恶性肿瘤 ncRNA 相关蛋白研究领域培养一批高水平 创新性人才，包括培养 15-20 名博士后等青年骨干人才， 70 80 名博士生， 100 名硕士生，产生百篇优秀博士论文 1-2 篇。三、研究方案1.总体学术思路：以非编码 RNA（
7、ncRNA）相关蛋白调控网络在肿瘤发生发展与治疗抗性中的作用研究作为总体目标，本 项目拟识别和鉴定一批肿瘤特异的 ncRNA，筛选并确定参与它们在肿瘤细胞中异常表达及行使生物学功能的相关蛋白质。此外，探索ncRNA 与相关蛋白之间的相互作用机制，及其 对肿 瘤细胞增殖、分化、 转移、凋亡和治疗抗性等的作用，最终阐 明肿瘤非编码 RNA 相关蛋白调控网络系统及功能，为人类认识肿瘤发生发展的分子机制和治疗癌症提供理论依据。总体研究方案图示如下：ncRNA 与调控其表达的蛋白相互作用识别和鉴定肿瘤ncRNA 与相关蛋白ncRNA 与行使其生物功能的蛋白相互作用ncRNA 对靶蛋白的作用与肿瘤发生发展
8、 与肿瘤治疗抗性解析肿瘤 ncRNA表达的调控机制 表观遗传机制对 ncRNA 表达的调控 转录因子对ncRNA 的调控 ncRNA 合成、加工成熟与修饰过程及其与蛋白质相互作用的机理 肿瘤启动细胞及其在各向分化过程中的ncRNA 及相关蛋白的时空表达谱 ncRNA 相关蛋白对肿瘤启动细胞的调控与肿瘤发生 ncRNA 相关蛋白对肿瘤血管生成的调控作用 ncRNA 相关蛋白参与肿瘤细胞迁移、EMT和肿瘤转移的机制研究 肿瘤细胞凋亡与自噬过程相关的 ncRNA及相关蛋白的筛选与鉴定 ncRNA 相关蛋白对肿瘤细胞凋亡和自噬过程的调控作用研究 ncRNA 相关蛋白在纳米颗粒引发的癌细胞自噬中的功能
9、ncRNA 相关蛋白对恶性肿瘤治疗抵抗作用的研究恶性肿瘤发生发展中的 ncRNA 及其相关蛋白调控网络 识别和鉴定新的肿瘤特异 ncRNA 及与其靶蛋白的作用机制 解析调控肿瘤 ncRNA 转录和加工修饰的蛋白质功能 阐明 ncRNA 相关蛋白对肿瘤启动细胞的调控作用与肿瘤发生的关系 揭示 ncRNA 相关蛋白对肿瘤血管生成与转移的作用与肿瘤发展的关系 探索 ncRNA 相关蛋白对肿瘤细胞凋亡和自噬的作用与肿瘤治疗抗性的关系技术途径及可行性：本项目在总体目标的架构下分为 4 个主要的课题方向（见课题设置），各课题方向的主要技术途径总结如下：课题 1：利用 RNA 组学研究方法，采用深度测序技术
10、、DNA 文库、基因芯片技术，高通量筛选和鉴定新的 肿瘤相关 ncRNA；采用基于生物 质谱分析的蛋白质组学技术、酵母三杂交技术 、SELEX 技术、免疫沉淀-RNA:随机聚合酶链反应方法，以及 CLIP(crosslinking and immunoprecipitation)方法、蛋白复合体分离 检测技术，结 合生物信息学技术 ，规模化地系统性筛选、 鉴定肿瘤特异性 ncRNA 相互作用蛋白，发现 ncRNA 与蛋白质相互作用规律。 课题 2：通过 DAC/TSA 处理法结合 MSP 和 ChIP 法，筛选、鉴定受表观遗传调控的 ncRNA；通过 DNA 亲和层析、ChIP-Seq、 荧光
11、素酶报告系统等方法在肿瘤细胞中检测转录因子与启动子的结合活性；通过免疫共沉淀、酵母三杂交、SELEX、CLIP 等技术分离和 鉴定与 ncRNA 结合蛋白；用筛选调控转录后加工关键蛋白的 miRNA；应用用免疫共沉淀方法鉴定 ncRNA 修饰蛋白，如 lin-28 等和候选 miRNA 前体的结合及体外催化实验鉴定恶性肿瘤细胞系中 ncRNA 修饰蛋白介导的候选 miRNA 前体尿嘧啶化；应用测序技术对 ncRNA 基因多态性进行分析。课题 3：通过 ncRNA 芯片、ncRNA 克隆和深度测序鉴定肿瘤启动细胞特异的 ncRNA 表达 谱；通过生物信息学预测、蛋白组学、蛋白差异表达分析以及RN
12、A 干 扰实验研究分离和鉴定 ncRNA 相关蛋白；通 过平皿培养、三 维 Matrigel培养、免疫缺陷鼠移植瘤系统、 ncRNA 表达/拮抗实验 研究 ncRNA 在肿瘤启动细胞中的生物学功能。采用划痕修复试验、 转移小室（Transwell ）的细胞迁移和侵润检测系统和荷瘤鼠转移模型等研究肿瘤转移能力；采用倒相性、荧光和共聚焦显微技术观察肿瘤细胞形态；采用小动物成像系统技术，动物外周学循环肿瘤细胞检测技术，组织学检测技术以及荧光定量 PCR 技术等检测 ncRNA 干预对恶性肿瘤转移的作用；通过免疫组化和免疫细胞化学等检测转移细胞 ncRNA 相关的蛋白通路激活状态。课题 4：通过亲和层
13、析法、酵母三杂交系统、 ChIP-RT-PCR 等技术筛选和鉴定 ncRNA 相关的凋亡蛋白；应用 THF 方法制备富勒烯纳米颗粒；用动态光散射、透射电镜、 HPLC 等技术测 定纳米颗粒的粒径、表面电势、浓度及分散度等理化性质；通过荧光观察 GFP-LC3 聚集， western 检测 LC3-I 向 LC3-II 的转化，电子显微镜观察自噬体及自噬溶酶体，western 检测 p62 和 Free GFP 等进行自噬检测；通过检测细胞自噬特征性的 GFP-LC3 点状聚集， 筛选 自噬相关 ncRNA；采用Western Blotting,免疫组化以及酶活性检测等手段研究 ncRNA 生成
14、过程中的重要蛋白质如 Drosha、Dicer 以及 Argonaute 2 在细胞自噬过程中表达水平、分子形式以及细胞内定位可能的变化。本研究团队中有相当部分的研究人员具有多年从事肿瘤学或肿瘤学相关基础研究的科研经验，其中在 Cell、Nature、Science、N Engl of Med 系列杂志上发表的文章中与肿瘤相关的占 60。各课题组建立了适合于肿瘤研究的 ncRNA 相关蛋白的实验平台和分析平台，包括上述绝大部分技术途径，建立了多种化学致癌物诱导人体细胞恶性转化的模型，建立了肿瘤启动细胞的研究平台以及富集肿瘤启动细胞的动物模型和细胞模型，建立了多种肿瘤细胞抗性模型，这些均为本研究
15、奠定了坚实的基础，保 证了该项目的顺利进行。2.创新点与特色理论方面创新：（1）首次研究以 ncRNA 为核心的基因表达的蛋白质调控网络：本研究从 ncRNA与蛋白质的相互作用入手，全面系统地解析以 ncRNA 为纽带的蛋白质功能网络对肿瘤的作用。一方面研究肿瘤细胞内调控 ncRNA 转录和加工的蛋白质功能，另一方面研究 ncRNA 与其相关蛋白组成的调控网络调节着肿瘤细胞编码蛋白质的癌基因和抑癌基因的表达，从而参与调节肿瘤细胞的多种生命现象。这一观点的提出与论证将为完善一个多通路、多层次的基因调控网络以解析恶性肿瘤的发生和发展机制奠定基础。（2）为恶性肿瘤的治疗提供新靶点：肿瘤的发生发展涉及
16、多个编码基因的变异，而细胞内源性的 ncRNA-蛋白 质调控网络可调节多种基因的表达，因此，改项目将为恶性肿瘤的治疗提供更稳定有效的抗癌靶点。此外，肿瘤启动细胞是肿瘤发生、复发和转移的根源，对化疗和放疗不敏感。本 项 目通过筛选决定肿瘤启动细胞分化和生长命运的 ncRNA 及其相关蛋白，不 仅为 治疗恶性肿瘤提供了新的靶点，还提供了合适的靶细胞群，这将成为新一代的肿瘤基因治疗手段。（3）为研究 ncRNA 相关蛋白调控肿瘤提供新的模型：本项目将着眼于恶性肿瘤内维持其生长的特殊细胞群肿瘤启动细胞，通过筛选、识别和鉴定参与调节恶性肿瘤启动细胞基因表达的 ncRNA 及其相关蛋白质，研究它 们对肿瘤
17、启动细胞分化命运的调控作用，从而为 ncRNA-蛋白质调控网络调节肿瘤发生发展的研究提供了一个动态的崭新的生物学模型。此外，最新的研究发现肿瘤细胞自噬与治疗抵抗有关，本研究通过分析自噬过程中 ncRNA 相关蛋白的功能，阐述其对肿瘤治疗抵抗的作用，为研究肿瘤治疗敏感性提供新模型。（4）在部分交叉研究领域进行首次研究：有关 ncRNA 及其相关蛋白调控肿瘤治疗抗性的研究在国际上才刚刚展开，目前尚缺乏系统和深入的研究；此外，目前文献中尚未有 ncRNA 相关蛋白调控细胞自噬的报道，结合课题组温龙平教授团队首次发现的纳米颗粒可以通过 ncRNA 调控细胞自噬，为纳米生物学及纳米安全性研究提供新线索。
18、技术方法创新：（1）RNA 组学平台在肿瘤特异 ncRNA 筛选中应用：本研究将采用 RNA 组学方法，并结合深度测序和计算生物学方法，建立高通量筛选和鉴定 ncRNA 技术平台，将有效地发现不同长度和类型的新的肿瘤特异的 ncRNA。（2）肿瘤相关 ncRNA 相互作用蛋白系统研究：本研究采用基于生物质谱分析的蛋白质组学技术、酵母三杂交技术、 SELEX 技术、CLIP(crosslinking and immunoprecipitation)方法以及蛋白复合体分离检测技术等多种新技术新方法，并有机结合计算生物学方法，理论与实验科学相结合，高通量和特异性相结合，是一种新的 ncRNA 相互作
19、用蛋白研究策略。 这也是国内首次开展大 规模的肿瘤特异的 ncRNA 及其相关蛋白的发现和作用机制研究。3.课题设置1）课题设置的思路本研究项目从发现和鉴定恶性肿瘤特异的非编码 RNA(ncRNA)与其相关蛋白质出发，分别从 ncRNA 调节轴心的上游和下游研究 ncRNA 和相关蛋白的相互作用及相互调控机制，并 阐述 ncRNA 及其相关蛋白在 肿瘤自然发生发展和治疗抵抗等病理过程中的作用。课题的设置围绕这一学术思路展开，分为 4 个分课题：（1）肿瘤 ncRNA 及其相互作用蛋白的系统识别 与机制研究；（2）肿瘤 ncRNA转录加工相关蛋白的功能研究；（3）ncRNA 相关蛋白 对肿瘤启动
20、细胞和肿瘤转移的调控作用，及其与肿瘤发 生发展的关系；（4）ncRNA 相关蛋白质调控肿瘤细胞程序性死亡以及治疗抗性的功能研究。课题一：肿瘤非编码 RNA 及其相互作用蛋白的系统识别与机制研究1.研究内容：1）筛选和鉴定新的肿瘤相关非编码 RNA以人常见肿瘤(肝癌、乳腺癌和食管癌等)细胞系和人癌组织及正常组织标本为研究对象，建立和发展高通量 ncRNA 筛选和鉴定技 术平台，针对不同的研究目的采用多种不同途径获得肿瘤特异的 ncRNA 分子。具体技术途径可包括：(1)采用 RNA 组学研究方法，分离制备 RNA，采用罗氏 454 测序技术或 Illumina Solexa 测序技 术等方法，
21、进行高通量测序分析和大规模筛选。 （2）分离制备 ncRNA分子，构建不同大小的 ncRNA 的 cDNA 文库(size-fractioned RNA library) （包括我们建立非编码小分子 RNA 建库技术，FEBS lett.2005,579: 3849-3854）和消减文库，对文 库进行大规模筛选 和高通量测序分析。 (3)采用 Invitrogen 公司最新推出的为检测长 ncRNA 设计的 NCode Noncoding RNA Array（包含 17112 个人ncRNA 分子）获得肿瘤特异的长度大于 200bp 的候选 ncRNA 分子；采用 miRNA芯片分析，获得肿瘤
22、特异的候选 miRNA 分子。针对获 得的新数据和已有数据，结合生物信息学方法高通量发现新的不同长度和类型的 ncRNA 分子， 获得常见肿瘤 ncRNA 表达谱， 筛选差异表达 ncRNA，获得常见肿瘤特异表达的候选ncRNA 分子。针对获得的肿瘤特异的候选 ncRNA 分子，采用 Northern blot、原位杂交 和/或实时定量 PCR 等技术对 大样本肿瘤和正常组织标本及癌细胞系进行进一步鉴定分析，最终获得肿瘤( 肝癌、乳腺癌和食管癌等 )ncRNA 表达谱和特异表达ncRNA。2）系统分析和鉴定肿瘤特异非编码 RNA 的相互作用蛋白质建立和完善规模化的肿瘤特异 ncRNA 相互作用
23、蛋白质发现、 筛选和分析的规范化技术体系，获得一批与 肿瘤特异 ncRNA 相互作用蛋白 质分子。针对获得的肿瘤特异 ncRNA 分子，采用基于生物 质谱分析的蛋白 质组学技术、筛选和鉴定 RNA 与蛋白质相互作用的酵母三杂交技术、SELEX(systematic evolution of Ligands by exponential enrichment)技术、免疫沉淀 -RNA:随机聚合酶链反应方法，以及 CLIP(crosslinking and immunoprecipitation)方法、蛋白复合体分离检测技术，结合生物信息学技术，筛选 、鉴定肿瘤特异性 ncRNA 相互作用候选蛋白
24、质。经肿瘤细胞内外验证，获得一批 肿瘤 ncRNA 相互作用蛋白 质分子，为 ncRNA 相关蛋白的生物学功能研究提供保证。miRNA 是目前哺乳动物细胞研究最成熟的 ncRNA，在分析和 鉴定 miRNA靶基因蛋白方面，本项目研究人员中山大学生科院的蒋嵩山副教授前期的研究构建了 600 多个人 miRNA 基因的慢病毒表达载体和质粒表达载体，通过内源性提高 miRNA 的表达，并进 行蛋白质组学分析，系 统 地筛查肿瘤相关 miRNA 的靶基因。结合通过同位素标记氨基酸的 SILAC 方法，可获得相关度非常高的miRNA-靶蛋白调节关系。在生物信息学软件预测的参考下，通过荧光素酶报告系统对
25、miRNA-靶蛋白调节关系进行鉴定，最终系统地获得肿瘤相关 miRNA 的调节谱，作为后续研究的基础。3）肿瘤特异非编码 RNA 与相互作用蛋白的作用机制阐明 ncRNA 与蛋白质相互作用的序列和结构规律对揭示 ncRNA 与相互作用蛋白质分子的作用机制具有重要意义。首先针对获得的 ncRNA 相互作用蛋白质，采用 计算生物学方法，以实验证实的 ncRNA 与蛋白相互作用为基础，开展基于机器学习的 ncRNA 与蛋白相互作用研究。探 讨三个 问题：与某一特定蛋白结合的若干 RNA 的结合区特征识别；与某一特定 类型 RNA 结合的若干蛋白的结合区特征识别；开展基于机器学 习的 ncRNA 与蛋
26、白相互作用的预测研究，构建分类模型，预测与某一特定 ncRNA 结合的所有可能蛋白或与某一蛋白 结合的所有可能 ncRNA，最 终为实验提供计算生物学支持。结合计算生物学的分析结果，对获得的肿瘤特异的 ncRNA 分子进行碱基或序列片段 进行替换、缺失，采用规模化研究蛋白质与 RNA 相互作用技术在细胞内外探索 ncRNA 与蛋白质相互作用，揭示蛋白质-ncRNA 的相互作用方式， 进而 发现 ncRNA 与蛋白质相互作用的序列和结构规律，为基 础和应用研究提供条件。4）肿瘤特异非编码 RNA 相互作用蛋白在肿瘤中的定性、定量和定位研究针对获得的肿瘤特异 ncRNA 及其相互作用蛋白质， 对各
27、种常见肿瘤标本进行定性、定量和细胞定位分析，揭示其在肿瘤中表达的 动态时空关系。 应用Northern Blot、实时定量 RT-PCR 技术和原位杂交等原位技术对肿瘤相关 ncRNA的表达进行定位和定性研究，以确认肿瘤相关 ncRNA 及其相关的靶基因蛋白在恶性肿瘤中的上调/下调关系。应用 Western Blot 和免疫组织化学技术，对肿瘤相关 ncRNA 相关蛋白在恶性肿瘤中的表达进行定量或半定量检测。 结合表达谱筛选数据，对肿瘤相关 ncRNA 及相互作用蛋白的角色即癌基因 /抑癌基因进行确认，并与功能研究衔接。 2.研究目标：1）建立肿瘤非编码 RNA 相互作用蛋白质高通量筛选和分析
28、技术平台。2）系统分析和鉴定一批新的不同长度和不同类型肿瘤特异性非编码 RNA 及相关蛋白，揭示非编码 RNA 及相关蛋白的相互作用机制。承担单位： 军事医学科学院课题负责人：郑晓飞研究员经费比例：23.71%课题二：肿瘤非编码 RNA 转录加工相关蛋白的功能研究1.研究内容：1）肿瘤 ncRNA 表达的表观遗传调控DNA甲基化和组蛋白修饰是ncRNA表观遗传学调控的主要形式，ncRNA之间的表达调控也属于表观遗传学调控的范畴。首先通过分析肿瘤表观遗传学改变与ncRNA表达 谱之间的关系获得候选的表观遗传 学调控的ncRNA 。然后验证ncRNA表达和启 动子区域DNA甲基化的对应关系，并比较
29、DNA 甲基化酶抑制剂（DAC）处理前后相关ncRNA的表达情况，确 认ncRNA表达受DNA 甲基化调控。应用抗活性乙酰化(acetyl-H3K9) 和甲基化组蛋白抗体（ dimethyl-H3K4、H3K36）特异识别处于活化状态的染色质；同时应用抗失活染色质的甲基化组蛋白抗体(trimethyl-H3K9、H4K20和trimethyl-H3K27) 进行染色 质免疫沉淀分析；结合TSA处理前后ncRNA的表达与组蛋白修饰状态以明确组蛋白修饰对ncRNA 的调控作用。ncRNA 本身也可通过与甲基化相关蛋白的相互作用 进而调控其它基因和ncRNA的表达。本研究还将通过分析肿瘤相关ncRN
30、A的表达与DNMTs 活性的关系筛选出调控DNMTs的候选ncRNA，并对其蛋白调控网络进行分析。2）肿瘤 ncRNA 转录因子的识别与功能鉴定为了识别和鉴定肿瘤 ncRNA 的转录因子，本 课题首先 应用 ncRNA 启动子区域作为诱饵从蛋白库中筛选出与其特异结合的蛋白质，并通过功能实验探讨该蛋白对肿瘤 ncRNA 转录的影响，并 进一步鉴定该转录 因子所调控的 ncRNA 转录谱。另一方面，应用 ChIP-Seq 方法在肿瘤细胞中检测并筛选与已知的肿瘤相关转录因子，如 c-myc、p53 等相结合的 ncRNA 基因启动子区域，以获得肿瘤相关转录因子的 ncRNA 基因启动子结合谱。3）肿
31、瘤 ncRNA 成熟加工的机制ncRNA 在转录后至成熟过程中，需 经过多种蛋白和 酶类的调控，我们将在肿瘤模型中研究 ncRNA 转录后加工相关蛋白的表达情况、并分析 过度表达或敲低后对肿瘤相关 ncRNA 表达谱的影响。通 过免疫共沉淀、酵母三杂交、SELEX、CLIP 等技术分离和 鉴定此过程中的调控蛋白并研究其功能。我们也将选择与各类 ncRNA 成熟加工相关的蛋白分子（如与 miRNA 加工相关的 Drosha、Dicer 及 Argonaute 2 等），将其基因的 3-UTR 克隆至双荧光素酶报告系统，采用课题组 1 创建的 miRNA 表达库在全基因 组范围内系统地筛选可能调控
32、这些蛋白的 miRNA，并 结合课题 1 中所鉴定的常 见恶性肿瘤特异性 ncRNA表达谱，通过两者交集探讨恶性肿瘤特异性 miRNA 对 ncRNA 在转录后至成熟过程的负反馈调控网络。4）肿瘤成熟 ncRNA 异常修饰的机制近期研究发现，ncRNA在代谢过程中被异常修饰将会 导致其降解，从而影响细胞内成熟ncRNA的水平。例如 lin28通过调节let-7前体尿嘧啶化介导的let-7前体降解。因此，本课题将识别和鉴定一批异常修饰肿瘤相关ncRNA 而导致其表达改变的蛋白质，并探讨其作用机制。在肿瘤标本中分析从 课题1中筛选、 鉴定的ncRNA相关蛋白与ncRNA表达水平的相关性。通过在肿瘤
33、细胞系中过度表达或用RNAi 方法沉默该候选蛋白的表达，观察不同成熟阶段的相关ncRNA的表达变化。进一步通过CLIP(crosslinking and immunoprecipitation)方法和体外催化实验鉴定相关蛋白与ncRNA的结合以及对其修饰的方式。此外，ncRNA 的序列多态性也是影响其成熟加工的重要因素。本 课题将应用测序技术对 ncRNA 基因多态性进行分析，明确 SNP 对肿瘤相关 ncRNA 成熟加工的影响。2.研究目标：1）明确肿瘤 ncRNA 表达的表观遗传调控机制及相关蛋白（酶）在 ncRNA-蛋白调控网路中的作用。2）分离和鉴定一批新的调控肿瘤相关 ncRNA 的
34、转录因子，并揭示其在ncRNA-蛋白 调控网路中的作用。3）获得一批肿瘤 ncRNA 加工成成熟过程及成熟后异常修饰相关的蛋白并阐明其功能。承担单位： 中国人民解放军总医院课题负责人： 郭明洲研究员经费比例：22.12%课题三、非编码 RNA 相关蛋白 对肿瘤启动细胞和肿 瘤转移的调控及其与肿瘤发生发展的关系1.研究内容：1）完成肿瘤启动细胞的 ncRNA 及相关蛋白表达谱肿瘤启动细胞在肿瘤组织内数量稀少，是制约其高通量分子表达谱研究的瓶颈，课题组前期研究建立了高效的肿瘤启动细胞筛选富集体系，即通过低剂量化疗选择压力，在荷瘤鼠中选择出具有高比例肿瘤启动细胞的肿瘤细胞株。该研究体系可以推广到其他
35、恶性实体瘤，以获得足够数量的肿瘤启动细胞供本研究所用。我们将（1）以各类常见恶性肿瘤的启动细胞作为材料，采用不同大小的 ncRNA 的 cDNA 文库（size-fractioned RNA library）和肿瘤启动细胞体外球囊培养扩增等策略构建各种肿瘤启动细胞专一性的小分子 ncRNA 的 cDNA 文库。对文库进行大规模筛选和序列测定分析，预期可发现一批肿瘤启动细胞特异的ncRNA。（2）结合 ncRNA 芯片及克隆测序技术，分析比较肿瘤启动细胞和相应的非启动癌细胞中 ncRNA 表达谱的差异，以及 肿瘤启 动细胞在向上皮型和间质型成熟癌细胞分化过程中 ncRNA 表达谱的变化，发现 和
36、鉴定肿瘤启动细胞特异表达的新 ncRNA。在此基 础上，我 们将在原发恶性肿瘤组织中分离原代的肿瘤启动细胞，通过 Northern 杂交法鉴定新发现的专一 ncRNA 表达，通过实时 PCR 对其定量，再通过原位杂交对其定位。 （3）通过计算机预测系统和蛋白组学技术分析和鉴定 ncRNA 相关的蛋白谱，并鉴定 ncRNA 相关蛋白质在各类原代肿瘤启动细胞的表达及其与 ncRNA 表达的相关性。2）ncRNA 相关蛋白对肿瘤启动细胞的调控作用通过前期研究所建立的一系列肿瘤启动细胞研究模型，分析 ncRNA-蛋白质调控网络对肿瘤启动细胞生物学特性，包括自我增殖能力、多向分化的潜能和体内成瘤能力的调
37、控作用。 （1）自我增殖是肿瘤启动细胞赖以维持自我的主要特征，也是恶性肿瘤发生和发展的源泉。无血清培养条件下， 肿瘤启动细胞在悬浮状态下形成细胞球囊（sphere），球囊形成率反映细胞自我增殖的能力。我们将进行专一性的 ncRNA 干预，然后分析 肿瘤启动细胞球囊形成率，并通过蛋白差异表达分析以及相关 RNA 干扰实验明确 ncRNA 相关蛋白与 肿瘤启动细胞球囊形成和自我增殖能力的关系。 （2）采用二维平皿及三维 Matrigel 培养和免疫缺陷鼠体内种植等研究体系，并利用上皮细胞和间叶细胞的表面标记物，进一步明确目标ncRNA 对肿瘤启 动细胞分化方向的影响。 （3）检测过 表达或沉默 n
38、cRNA 后肿瘤启动细胞成瘤能力的变化，并分析 ncRNA 相关蛋白的 调控网络，以阐明 ncRNA-蛋白调控网络与肿瘤发生的关系。3）ncRNA 相关蛋白对肿瘤转移的作用在课题 1 识别和鉴定肿瘤特异 ncRNA 和相关蛋白特异表达谱的基础上，我们将进一步筛选鉴定与肿瘤细胞转移密切相关的 ncRNA 及其相关蛋白，在体外和体内模型中研究这些 ncRNA 及其相关蛋白质对肿 瘤细胞转移特性的调节作用与机制。首先，我们在肿瘤细胞中转导目标 ncRNA 的表达序列或者其拮抗序列，然后：采用划痕修复和转移小室（Transwell）技术检测 ncRNA 干预对肿瘤细胞迁移（Migration ）和侵袭
39、（Invasion）的作用，并分析相关蛋白通路的激活状态；采用倒相性、荧光和共聚焦显微技术，以及 Matrigel 细胞三维培养系统观察ncRNA 干预对肿瘤细胞 EMT 形状的作用，并鉴定调节 EMT 的蛋白信号分子的激活状态；在免疫缺陷鼠 肾包膜或皮下种植以及鼠尾静脉注射 肿瘤细胞，采用活体成像技术，组织病理学检测以及荧光定量 PCR 等技术检测 ncRNA 对恶性肿瘤转移的调控作用，同时，通 过免疫组化和免疫荧光等检测转移细胞 ncRNA相关的蛋白通路激活状态。4）ncRNA 相关蛋白对肿瘤血管生成的调控作用肿瘤血管生成是恶性肿瘤发展过程的重要事件，研究证实肿瘤细胞可以通过分泌促血管生成
40、因子， 诱导血管内皮细胞向肿瘤组织迁移并增殖，也可以诱导组织内多能干细胞分化为血管内皮细胞。最近的研究还发现，肿瘤启动细胞也可向血管样内皮的方向分化，形成肿瘤的新生血管。因此，本 课题中我们将探索在恶性肿瘤的微环境中 ncRNA-相关蛋白质调控网 络对血管内皮细胞的增殖、分化与迁移的调控作用，及其与肿瘤血管生成的关系。具体研究内容包括： 基于课题 1 所建立的 ncRNA 及其相关蛋白的检测平台，在与肿瘤细胞共培养的模型里，分析正常组织干细胞向血管内皮细胞分化过程中，以及血管内皮细胞增殖过程中 ncRNA 及其相关蛋白的时空变化规律，筛选 出与血管内皮增殖和分化相关的 ncRNA 及其相关蛋白
41、；通过在血管内皮细胞以及正常组织干细胞转导ncRNA 表达序列或其拮抗序列，分析上述筛选的 ncRNA 及其相关蛋白对肿瘤细胞所诱导的血管内皮细胞增殖、分化和迁移的作用； 在肿瘤启动细胞向血管样内皮细胞分化的模型中，通 过转导上述筛选的 ncRNA 表达序列或拮抗序列，分析其调控作用。2.研究目标：1）完成肿瘤启动细胞的 ncRNA 及相关蛋白表达谱2）揭示 ncRNA 相关蛋白对肿瘤启动细胞的调控机制及其与肿瘤发生的关系3）阐明 ncRNA 相关蛋白对肿瘤血管生成、侵 袭、 转移和 EMT 转化的调控机制承担单位：中山大学课题负责人：宋尔卫教授经费比例：30.46%课题四：非编码 RNA 相
42、关蛋白质调控肿瘤细胞程序性死亡以及治疗抗性的功能研究1. 研究内容：1）ncRNA 相关蛋白在肿瘤细胞凋亡中的功能研究利用课题 1 中系统筛选和鉴定所得到的与细胞凋亡相关的 ncRNA，在 细胞及动物整体水平上揭示这些 ncRNA 所调控的靶蛋白参与细胞凋亡的传导通路，并阐明这些 ncRNA 相关蛋白影响肿瘤发生发展的分子机理。在此基础上，我们将从调控细胞凋亡的关键蛋白入手，针对性地选择在凋亡过程中起关键作用的（master regulator）促凋亡或抗凋亡 调控蛋白（例如 p53、E2F1、Puma、Bax、Bcl-2、Bcl-xL 等），将这些基因的 3-UTR 克隆表达，然后利用课题
43、1 创建的 miRNA表达库来系统筛选影响凋亡/抗凋亡的新的 ncRNA；我们还将利用 IP-ChIP 和酵母三杂交系统寻找与这些 3-UTR 相结合的蛋白，进一步探索这些与 3-UTR 相互作用的新的 ncRNA 和新的蛋白(novel proteins)是如何通过调控细胞凋亡或抗凋亡来影响肿瘤的发生发展。miR-17-92 cluster 是目前公认的第一个非编码癌基因（Noncoding oncogene，OncomiR-1）,它在许多肿瘤中都呈现高表达。Mir-17-92 本身是受 Myc正调控，但它又能正向调控 E2F1、PTEN 以及 Bim 等众多由它们介导的肿瘤调控网络通路；M
44、ir-17-92 同 时还受到 hnRNPA1 的成熟加工的调控，因此，miR-17-92 是研究 ncRNA 凋亡网络的典范。我 们初步的研究 证实：B23 通过与 hnRNPA1相互作用调控 mir-17-92 的在细胞内的水平。因此，我们将以 mir-17-92 的研究为切入点，探索它参与细胞凋亡和肿瘤发生的复杂的分子调控机理。2）ncRNA 相关蛋白在肿瘤细胞自噬中的功能研究以我们已构建的稳定表达 GFP-LC3 蛋白的乳腺癌和 HeLa 癌细胞系为实验系统，利用 课题 1 创建的 ncRNA 表达库， 筛选出能诱导或抑制癌细胞自噬的ncRNA，然后鉴定这些 ncRNA 的靶蛋白及其调
45、控细胞自噬的分子机理；针对性地选择一些已知在细胞自噬过程中起着关键调控作用的关键蛋白质如 Beclin-1和 ATG5，筛选 能调控这些蛋白质表达水平的 ncRNA，并验证所得到的 ncRNA在细胞自噬过程中的功能；探讨 ncRNA 生成过程中的重要蛋白质如Drosha、Dicer 以及 Argonaute 2 在细胞自噬过程中表达水平、分子形式以及细胞内定位可能的变化；在现有工作基础上进一步确认 ncRNA 及相关蛋白在纳米颗粒引发的癌细胞自噬中的变化，并通过过表达和 Knock-down 等手段揭示这些ncRNA 及相关蛋白在细胞自噬中所起的作用。3）ncRNA 相关蛋白在肿瘤治疗抗性中的
46、功能研究（1）肿瘤治疗抗性相关模型建立与组织样本的收集：建立一系列针对各类肿瘤治疗产生抵抗作用的肿瘤治疗抗性模型，包括对化疗、放疗、内分泌治 疗和靶点药物治疗的抗性模型；收集在术后经历了不同种类的辅助治疗的病人的样本并制作组织芯片，同时收集病人的临床治疗和完成 5 年随访工作。（2）肿瘤治疗抗性相关 ncRNA 的筛选和鉴定：一方面运用肿瘤治疗抗性相关模型和课题 1 建立的方案分离和构建不同大小的 ncRNA 文库(size-fractioned RNA library)和消减文 库，运用 Illumina Solexa 测序技术等方法对文库进行大规模筛选和高通量测序分析，结合生物信息学方法高
47、通量发现新的 ncRNA 分子以及筛选差异表达 ncRNA，获得肿瘤治疗抗性特异表达的候 选 ncRNA 分子。在前期课题组各团队收集的肿瘤患者标本中，通过实时定量 RT-PCR 和原位杂交等研究所筛选的 ncRNA 表达。 另一方面，从与肿瘤治疗抗性相关的蛋白质入手，选择对各种治疗抗性起重要调控作用的因子（如 HER2、ER，Met、EGFR 等）及其相关的信号传导通路中的关键分子（如 ATM、CHK-1,2，BRCA1、Akt， MPAK 家族等），通过系统地克隆其 3UTR，并利用已经创建的 ncRNA 表达库来系统筛选并鉴定与上述因子关联的新的 ncRNA。（3）肿瘤治疗抗性相关 nc
48、RNA 相关蛋白的筛选和鉴定：利用前期构建的 ncRNA的慢病毒表达载体库，通过瞬时提高或沉默内源性特定 ncRNA 的表达，并进行SILAC 定量蛋白组分析，系统地筛查肿瘤相关 ncRNA 的靶蛋白；利用 SELEX、亲和层析富集和纯化以及酵母三杂交系统等技术发现和鉴定此抗性过程中与这些 3-UTR 相结合的蛋白，从而进一步探索肿瘤抗性中 ncRNA 相关蛋白的调控网络。通过 Western Blot 和免疫组化等研究 ncRNA 相关蛋白的表达。（4）肿瘤治疗抗性相关 ncRNA 相关蛋白的功能研究：运用细胞生存和凋亡检测研究 ncRNA 相关蛋白在过表达或者表达沉默的状态下肿瘤细胞对治疗
49、药物的敏感性；进一步揭示 ncRNA 相关蛋白调控治疗抗性的相关信号传导通路2. 研究目标：1）阐明非编码 RNA 相关蛋白在肿瘤细胞凋亡和自噬过程中的分子调控机理。2）揭示非编码 RNA 相关蛋白在治疗抗性中的作用机制和信号传导通路。承担单位： 中国科学技术大学课题负责人：吴缅教授经费比例：23.71%4.课题间相互关系本项目设置的 4 个课题分别从功能和机制两个角度探索肿瘤特异 ncRNA 相关蛋白在恶性肿瘤自然发生发展和治疗抗性中所扮演的角色。课题 1 为其它课题提供筛选与鉴定平台，拟发现一批肿瘤相关 ncRNA 与相关蛋白。在此基础上，课题 2 则沿 ncRNA-相关蛋白 轴心向上游鉴定肿瘤 细胞内调控 ncRNA 表达的蛋白质及其功能，而课题 3 与 4 则分别从肿瘤发生发展和治疗抗性两个方面研究ncRNA-相关蛋白 轴心下游的功能网 络。四个课题是预期目标的四个有机组成部分，其相互关系如下图所示：课题 1：肿瘤ncRNA 及相关蛋白筛选和鉴定平台课题 2：调控肿瘤ncRNA 转录和加工修饰的相关蛋白质功能课题 3：调控肿瘤发生发展的ncRNA 相关蛋白功能课题 4：调控肿瘤治疗抗性的ncRNA 相关蛋白功能上游：调控机制下游：功能网络课题设置与项目总体目标的关系针对本项目的总体目标，课题
