Western_Blot_原理和操作方法(全).doc

1、Western Blot 原理和操作方法 （全）工作原理蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100g),分辨率高,可检出 10-9-10-12mol 的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用.SDS-PAGE 是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.PAGE

2、 能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而 SDS-PAGE(SDS 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理 则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为 SDS-PAGE 的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有 SDS 和巯基乙醇(2-ME) 或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS 是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮 3-5 分钟使 SDS 与蛋白质充分结合形成 SDS-蛋白质复合物,SDS-

3、蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS 与蛋白质结合后使 SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个 SDS 分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS 掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基.样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到

4、达凝胶底部时,即可停止电泳.另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.重要参数聚丙 烯酰胺凝胶 (PAG)制备 原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T) 以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C) 决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算:T%=(a+b)/m*100%; 和 C%=a/(a+b)*100%其中: a=双体(bis)的重量 ;b=单体(arc) 的重量 ;m=溶液的体 积(ml)当分析一个未知样品时,常常先用 7.5%的标准凝胶制成 4-10 的梯度凝胶进行试验,以便选择理想

5、的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度: 蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%)5105 2-5蛋白分子量 (kDa) 凝胶浓度 (%)4-40 2012-45 1510-70 12.515-100 1025-200 8分离胶（ 5ml 体积）:(ml)浓度6% 8% 10% 12% 15%DDH2O 2.6 2.3 1.9 1.6 1.130%丙烯酰胺混合液 1.0 1.3 1,7 2.0 2.51.5mol/L Tris (pH 8.8) 1.3 1.3 1,3 1.3 1.310% SDS 0.05 0.05 0.05 0.05 0.0510% 过硫酸铵（A

6、P） 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05TEMED 0.004 0.003 0.002 0.002 0.0025%的积层胶的配置：蛋白质的样品制备：蛋白质的样品制备是 Western Blotting 的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题 ：1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白 质的最大溶解性和可重复性。2：选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价 结合的蛋白 质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。3：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。4：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制 备过程 应在低温下进行，以避免 细胞破碎释放出

7、的各种酶类的修饰（建议加入合适的蛋白酶抑制剂）5：样品建议分装成合适的量，然后冷 冻干燥或直接以液体状 态置-80中保存，但要注意不要反复冻融。一：准备工作：一个水浴箱，一台超声装置，组织匀浆器二：需要的溶液：裂解液 Laemmli 样品缓冲液三：操作步骤：1)培养细胞蛋白质样品的制备 ：1：胰酶酶解后裂解：细胞培养至 80%左右密度时，以含 0.05%胰蛋白酶消化，细胞经预冷的 PBS 漂洗 3 次，离心收集在离心管中，加入 450l裂解液反复吹打。2：皿上直接裂解：细胞培养至 80%左右密度时，细胞经预冷的 PBS 漂洗 3 次，加入 450l裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，

8、反复吹打。以上所得的样品最终用超声细胞破碎仪超声处理，超声 时为 5S，间歇时间为 10S，功率为100-120W 至溶液清澈无粘稠为止，处理过程在水浴中进行，后 425000g 离心 1 小时取上清或以最大强度超声 4 次，每次 15-30S，在每次超声步 骤 之间将样品转置水浴中 15S，加入Laemmli 样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以 1：1 或 1：2 的比例混合），强力混匀，样品置100水浴箱里水浴加热 3-5 分钟， 10000g 离心 10 分钟，取出清液，将其移入另一洁净试管中，至此，电泳样品已准备就绪。 （样品可立即使用也可以分装冻存，-20存放的样品可稳定保持数月）2)组

9、织样品的制备：(ml)体积（ml）1 2 3 4 5DDH2O 0.68 1.4 2.1 2.7 3.430%丙烯酰胺混合液 0.17 0.33 0.5 0.67 0.831.0mol/L Tris (pH 6.8) 0.13 0.25 0.38 0.5 0.6310% SDS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.0510% 过硫酸铵（AP） 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05TEMED 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005手术切除的组织块迅速置于预冷的 0.95 生理盐水中，漂洗数次，以清洁表面的血迹，将组织称量后切成几个较小的组织块放入机戒组织匀

10、浆器中，按组织净重，裂解液 =1：10 的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声 处理，具体方法 见细胞培养的样品制备，也可以冷冻 干燥降解核酸后，将 冻干的蛋白 质样品溶解在适当的上样 buffer 中，混匀后静置 3 小时使样品中的蛋白质充分的溶解，有 5 分钟即可，4 度离心收集。 ）加入 Laemmli 样品缓冲液（视 蛋白样品浓度，以 1：1 或 1：2 的比例混合）强力混匀，样品置100 度的水浴箱水浴加热 3-5 分钟，10000g 离心 10 分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中，至此，电泳样品已准备就绪（样品即可立即使用也可也可以分装冻存，-2

11、0存放的样品可稳定保持数月。 ） 蛋白质的样品制备：蛋白质的样品制备是 Western Blotting 的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题 ：1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白 质的最大溶解性和可重复性。2：选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价 结合的蛋白 质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。3：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。4：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制 备过程 应在低温下进行，以避免 细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（建议加入合适的蛋白酶抑制剂）5：样品建议分装成合适的量，然后冷 冻干燥或直接以液体状 态置-

12、80中保存，但要注意不要反复冻融。一：准备工作：一个水浴箱，一台超声装置，组织匀浆器二：需要的溶液：裂解液 Laemmli 样品缓冲液三：操作步骤：1)培养细胞蛋白质样品的制备 ：1：胰酶酶解后裂解：细胞培养至 80%左右密度时，以含 0.05%胰蛋白酶消化，细胞经预冷的 PBS 漂洗 3 次，离心收集在离心管中，加入 450l裂解液反复吹打。2：皿上直接裂解：细胞培养至 80%左右密度时，细胞经预冷的 PBS 漂洗 3 次，加入 450l裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。以上所得的样品最终用超声细胞破碎仪超声处理，超声 时为 5S，间歇时间为 10S，功率为100-12

13、0W 至溶液清澈无粘稠为止，处理过程在水浴中进行，后 425000g 离心 1 小时取上清或以最大强度超声 4 次，每次 15-30S，在每次超声步 骤 之间将样品转置水浴中 15S，加入Laemmli 样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以 1：1 或 1：2 的比例混合），强力混匀，样品置100水浴箱里水浴加热 3-5 分钟， 10000g 离心 10 分钟，取出清液，将其移入另一洁净试管中，至此，电泳样品已准备就绪。 （样品可立即使用也可以分装冻存，-20存放的样品可稳定保持数月）2)组织样品的制备：手术切除的组织块迅速置于预冷的 0.95 生理盐水中，漂洗数次，以清洁表面的血迹，将组织称量后切

14、成几个较小的组织块放入机戒组织匀浆器中，按组织净重，裂解液 =1：10 的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声 处理，具体方法 见细胞培养的样品制备，也可以冷冻 干燥降解核酸后，将 冻干的蛋白 质样品溶解在适当的上样 buffer 中，混匀后静置 3 小时使样品中的蛋白质充分的溶解，有 5 分钟即可，4 度离心收集。 ）加入 Laemmli 样品缓冲液（视 蛋白样品浓度，以 1：1 或 1：2 的比例混合）强力混匀，样品置100 度的水浴箱水浴加热 3-5 分钟，10000g 离心 10 分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中，至此，电泳样品已准备就绪（样品即可

15、立即使用也可也可以分装冻存，-20存放的样品可稳定保持数月。 ）附：一：裂解液的制备：组织裂解液（全细胞蛋提取）：1：Tris-HCL 50mmoL/L PH 7.42: Nacl 150 mmoL/L3: 去氧胆酸钠 0.25%4：NP-40 或 Triton-x-100 1%5: EDTA 1 mmoL/L6： PMSF 1 mmoL/L7： Aprotinin 1g/ml8: leupeptin 1g/ml9: pepstain 1g/ml其中:7,8,9 作用不持久，要使用前加入。细胞裂解液：1：NP-40 裂解体系： 150 mmoL/L Nacl1.0%NP-40 或 Triton

16、-x-100 50 mmoL/L Tris(PH8.0)2：RIPA 裂解体系：150 mmoL/L Nacl1.0%NP-40 或 Triton-x-1000.5%脱氧胆酸钠0.1%SDS50 mmoL/L Tris( ph8.0)二：1*loading Buffer 样品缓冲液配置（ 1*SDS 样品缓冲液）50 mmoL/L Tris-HCL （PH8.0）100 mmoL/L DTT(二硫苏糖醇)2% SDS0.1% 溴酚蓝10% 甘油此液可以配置成不同的储存液，根据蛋白 浓度而定， 40C 长期保存，用时临时与蛋白液按比例混合，其中 DTT 应临时加入，以防降解。 蛋白质定量1)Br

17、adford 法:检测原理: Bradford 与蛋白质四级结构,特殊氨基酸结合,由棕色变成蓝色,595nm 检测.该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不使用于小分子碱性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污剂的浓度超过 0.2%影响测定结果,如 TritonX-100,SDS,NP-40 等.Bradford 法浓染液的配制: 将 100mg 考马斯亮蓝 G-250 溶于 50ml 95%乙醇,加入 100ml 浓磷酸;然后,用蒸馏水补充至 200ml;此染液放 4至少 6 个月保持稳定.标准曲 线蛋白 质样本的制备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯

18、化的抗体作为标准,如果待测样品是未知的,也可用抗体作为标准蛋白,通常在20g -150g/100l之间绘制标准曲线.将待 测样本溶于 100l缓冲溶液中 ,该缓冲溶液相同(最好用 PBS)按照 1:5 用水稀释浓燃料结合溶液,如果出现沉淀,过滤除去.每个 样品家 5ml 稀释的燃料 结合溶液,作用 5-30 分钟,燃料与蛋白结合,将由红色变为兰色,在595nm 波长下测定其吸光度, 注意显色反应不超过 30 分钟.根据 标准曲 线计算待测样品的浓度. 2)Lowry 法:检测原理: 是 Cu2+与蛋白作用生成的 Cu+与双缩脲试剂形成兰色络合物,菲林试剂增强兰色形成,750nm 检测.首先 ,

19、将 20g 碳酸钠溶于 500ml 水中;再将 1g CuSO4.5H2O 和 2g 酒石酸钠溶于 500ml 蒸馏水中;将铜/酒石酸钠溶液放在磁力搅拌器上搅拌缓缓加碳酸 钠溶液,储存于冰箱中,可稳定保存 1 年以上.Folin-ciocalteu 酚试剂按体 积比 1:2:1 将铜/酒石酸/ 碳酸钠,5%SDS 和 0.8mmol/l NaOH 溶液混合,室温下储藏,可稳定保存 2 周,标明为试剂 A按体 积比 1:5 将 Folin-ciocalteu 酚试剂和 H2O 混合,室温下储存于琥珀色试剂瓶中,可稳定保存 1 个月,表明为时机 B用蒸 馏水将 样本(5-100g)稀释为 1ml,

20、并准备 100,50,25,12.5g /ml,4 个浓度的 BSA 作为标准蛋白.每个蛋白 样 品家 1.0ml 试剂 A,混合均匀,在室温下孵育 10 分钟.加入 0.5 ml 试剂 B 并立即混合, 在室温下孵育 30 分钟.在 750nm 光波长下测定吸光度; 根据标准曲线计算样本蛋白 质的浓度.3)紫外分光光度法:检测原理:是因蛋白质样品在 280nm 波长下有最大吸光率 ,最大吸光率主要取决于酪氨酸和色氨酸的存在.纯化蛋白 质浓 度的测定:在 280nm 波长下读取与适当对 照相比较的吸光值.对于抗体和 BSA,可按照下述 标准计算其浓度,对其他蛋白 质粗略地估计:1 单位吸光值相

21、当于 1mg/ml蛋白质 A280(1mg/ml)IgG 1.35IgM 1.2BSA 0.7含有核苷酸的蛋白质溶液浓度的测定:蛋白质浓度(mg/ml)=(1.55*A280)-(0.76*A260)蛋白质浓度(mg/ml)=A205(27+120A280/A205)1)SDS-PAGE 设备 和材料电泳装置（垂直板电泳槽）为北京六一仪器厂生产的 DYCZ-24D 型电泳装置。电泳 仪（电源） 为北京六一仪器厂生产的 DYY-8B 型。振荡 器2）试剂丙烯酰 胺（电 泳级）N,N-甲叉双丙烯酰胺（bis）SDSTEMEDTris过硫酸 铵-巯基乙醇或 DTT甘油甘氨酸溴酚 蓝11 盐酸3）聚胶

22、前准备：配制凝胶 储 液： T%=30% C%=1% arc:bis=29:1 过滤后 4避光保存。配制 浓缩胶 缓冲液： 1.0mol/L TrisHCl Ph6.8, 过滤后 4避光保存。配制分离胶缓冲液： 1.5mol/L TrisHCl Ph8.8, 过滤后 4避光保存。配制 10%SDS配制 10%过 硫酸铵（AP ）TEMED 原溶液电泳 缓冲液（ 5）：Tris 15g+甘氨酸 72g+SDS 5g+H2O 至 1L,临用时稀释 5 倍至 1SDS 电泳缓冲液加入电泳槽中。4)制胶: 制胶关键是聚合时间 ,最好是分离胶聚合控制在分离胶从加入 10%AP 和 TEMED起至开始出现

23、凝胶的时间为 15-20 分钟（并不是此时已凝聚完全）。对浓缩胶最佳聚合速度为 8-10min 开始可见聚合，可以通过调节 AP 和 TEMED 的加入量来控制，因液体中含有分子氧可抑制凝胶的聚合，故用时可在真空中抽气以排除液体中的分子氧，灌完分离胶后加水以封闭分离胶与外界氧气的结合， 总之，要掌握一个原 则：即用尽量少的催化 剂在最佳时间聚合。按比例配制分离胶，轻缓地摇动溶液（8-10 下），使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平 缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水或正丁醇，以阻止氧气进入凝胶溶液中，然后静置 90min。同前按比例配制浓缩胶，但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入 过多地氧气

24、。吸去不 连续系统中下层分离胶上的水分，以 连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制 90min 以上以保证完全聚合。5)预电泳： 将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入上下槽电泳缓冲液后低电压短时间的预电泳（恒压 10-20V,20-30min），清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通。6)加样： 预电泳后依次加入标准品和待分析样品，注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样 的孔中加入等量的样品缓冲液。7)电泳： 加样完毕，盖好电泳槽的盖子并选择适当的电压进行电泳，通常在连续系统中，上层浓缩胶的电泳电压要低于

25、分离胶的电泳电压，使 样品更好的 进入凝胶， 电泳时，应采用恒压的模式，这样蛋白质才可以保 证恒定的电泳迁移率。一般采用恒压浓缩胶 80V，分离胶120V，电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处，即停止 电泳。8 转膜：杂交膜的选择是决定 Western blot 成败的重要环节。应根据杂交方案、被 转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和 规格的 杂交膜。用于 Western blot 的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和 PVDF 膜。NC 膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数 带负电荷的蛋白质会与膜 发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非

26、离子型的去污剂作用下， 结合的蛋白还 可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的 NC 膜。因 为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用 0.45m和 0.2m两种规格的 NC 膜。大于 20kD 的蛋白可用0.45m的膜，小于 20kD 的蛋白就要用 0.2m的膜了，如用 0.45m的膜就会发生“Blowthrough”的现象。PVDF 膜灵敏度、分辨率和蛋白 亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但 PVDF 膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和 1-5 秒钟。蛋白质常用的转移方法主要有两种：槽式湿转和半干转移。前者操作容易，转移效率高；而后

27、者适用于大胶的蛋白转移，所用 缓冲液少。以下 为槽式湿转 的操作步骤。 将胶浸于 转 移缓冲液中平衡 10min。注意：如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。 依据胶的大小剪取膜和滤纸 6 片，放入 转移缓冲液中平衡 10min。如用 PVDF 膜需用纯甲醇浸泡饱和 3-5 秒钟。装配 转移三明治：海 绵?3 层滤纸?胶?膜?3 层滤纸?海绵 ，每层放好后，用试管赶去气泡。切记：胶放于负极面（黑色面）。 将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为 0.3A）。注意： 应再次 检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。

28、转膜结束后，切断电源，取出杂交膜9)染色和脱色电泳完毕需通过染色和脱色评定其结果的优劣.对凝胶中分离成不同条带的蛋白进行检测.此外,根据不同的研究目的,也可将凝胶电印迹考马 斯亮蓝 染色:将凝胶取出放入培养皿中到如少量的染色液,以浸没凝胶为宜,在摇床上震荡,直到凝胶上出现明显的条带为止,一般 5-6 小 时或者 4过夜; 然后倾去染色液，用脱色液洗涤震荡,其间要不断换脱色液,直至脱色液颜色稍清亮.,凝胶背景清楚为止.染色液配制:90ml 甲醇和 H2O 混合溶液(甲醇 :水=1:1,V/V)和 10ml 冰乙酸的混合溶液中溶解 0.25g 考马斯亮蓝 R250 用滤纸过滤染液以除去 颗粒不溶性

29、物质.脱色液的配制:90mL(甲醇):H 2O(1:1 V/V)和 10ml 冰乙酸溶液.附：一、蛋白标准品的选择凝胶电泳中一个关键的指示系统，即蛋白 标准品（Molecular Weight Marker），电泳的分离效率，转膜效率以及电泳泳动情况等，皆需通过蛋白标准品来 显示，目前普遍采用的几种蛋白标准品有： Blue RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker Mix Trichrom RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker Mix以上两种 Marker 均为 PI

30、ERCE 公司的产品，货号为：prod# 26681; prod# 26691;该标准蛋白不需染色，在电泳凝胶中随着蛋白 质的迁移，各种分子质量的标准蛋白逐渐分开，而显示出非常漂亮的多色条带，可通 过电泳槽直接肉眼观察各 电泳带的凝胶中的泳动情况，当相对于目的蛋白大小的标准蛋白与相邻两条标准蛋白达到所需分辨距离时，即可停止电泳，取出凝胶做进一步的转膜工作。 Chemiluminescent BlueRangerR peroxidase-Labled protein Molecular Weight Marker Mix 以上也为 PIERCE 产品，货号为：prod# 26651，该标准蛋白同

31、上也具有以上作用外，同时在使用化学发光时，和样品一起显 色经胶片曝光后，在胶片上可出现漂亮的条带。 Blotinylated SDS Molecular Weight Marker Mix以上为 Sigma 公司产品，货号为 B2787,作用效果同二、对照的设置一般需要设立:内参照, 提示系统的稳定性,一般是一些管家蛋白阳性对照, 即肯定可以表达你的目的蛋白的组织或者细胞,同时可以提示你一抗的质量阴性对照: 即肯定不会表达你的目的蛋白的 组织或者细胞.在实验中根据你的需要选择免疫印迹蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经 SDS-PAGE 后,分离为不同条带,其中含有能与特异性抗体(或 McAb)相

32、应的待检测的蛋白质( 抗原蛋白),将 PAGE 胶上的蛋白条带转移到 NC 膜上此过程称为 blotting,以利于随后的检测能够的进行,随后,将 NC 膜与抗血清一起孵育,使第一抗体与待检的抗原决定簇结合(特异大蛋白条带), 再与酶标 的第二抗体反应,即检测样品的待测抗原并可对其定量.一、 设备和材料转移电泳槽和转移电泳仪(电 源)震荡器冰箱滤纸NC 膜胶片暗室二、 试剂封闭液:5%的脱脂牛奶粉 TBS-T第一抗体(Ab1)第二抗体(标记的 Ab2)底物以及显色指示剂漂洗液(TBS-T)转印缓冲液抗体稀释液丽春红 S 显影液定影液三、 试剂的配制封闭液: 5g 的脱脂牛奶+100ml 的 T

33、BS-T漂洗液(TBS-T): 0.01M TBS-T 为 Tris 1.21g+ NaCl5.84g+800ml H2O 用 HCl 调节 PH 到 7.5,假如 0.05%或者 0.1%Tween-20 用 H2O 定溶至 1000ml转印缓冲液: 同 5SDS 电泳缓冲液,不含 SDS,如果采用 PVD 干膜或 NC 膜加 20%甲醇,不加甲醇也可以Tris 15g+甘氨酸 72g 加水定容到 1000ml,一般不需调节 PH 值 ,用时稀释 5 倍到 1转印缓冲液.显影液：H2O-750ml 米土尔-3g 无水亚硫酸钠-100g 对苯二酚-3g 溴化钾-3g 无水碳酸钠：先加 5gPH

34、10.0 不够时再加 5g注：以上配定加 H2O 定容至 1000ml定影液：起始水温：60 H 2O 700ml硫代硫酸钠：240g无水亚硫酸钠：25g冰醋酸：48ml注：加 H2o 至 1000ml四、 电印迹蛋白质经 SDS-PAGE 分离后，必须从凝胶中转移到固相支持物上，固相支持物具有牢固结合蛋白又不影响蛋白质 Ag 活性，而且支持物本身还有免疫反应惰性等特点，常用的支持物有：硝酸纤维膜（NC 膜）或 PVDF 膜。蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法，分 为半干式和湿式 转印两种模式。一 半干式电转印1. Tris/甘氨酸-SDS-PAGE 结束后，取出凝胶，在 Tris/甘

35、氨酸缓冲液中漂洗数秒。取凝胶方法：用刀片将两玻璃板分开，将多余的凝胶划去，上部以浓缩胶为准全部弃去，下部以分子量标准最小分子带下一点全部划去，取一 10ml 注射器注满转印缓冲液，插入玻璃板与凝胶之间注水，使水的压力将两者自然分开 ,边推边进,反复多次注水 ,直至凝胶从玻璃板上滑落下来。2. 将 NC 膜和滤纸切出与凝胶一样大小，置 转移缓冲液中湿 润 5-10min.3. 按照以下顺序放置滤纸，凝胶和 NC 膜到半干槽中。4. 每层之间的气泡要全部去除。可以用 10ml 吸管轻轻在上一层滚动去除气泡，然后用一绝缘的塑料片中间挖空与凝胶一样大小或略小一点，以防 电 流直接从没有凝胶处通过造成短

36、路，盖好加上阳极电极板。二湿式电转印1. Tris/甘氨酸-SDS-PAGE 结束后，取出凝胶，在 Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。取出凝胶方法同半干式电转印。2. 打开电转 印夹，每 侧垫上一块专用的用转印液浸泡透的海面垫，再各放一块转印液浸透的滤纸，滤纸与海面垫大小相同或与 NC 膜，凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极 侧滤纸上，最后将 NC 膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹。3. 电泳槽加 满电转印液，插入电转印夹，将 电泳槽放入冰箱内（电转印液之前要放入冰箱内预冷），连接好电极，接通电流，转印夹的 NC 膜应对电泳槽的正极。五、印迹膜上总蛋白的染色在确定印迹中是否存在总蛋白之前

37、,通过对硝酸纤维素膜染色可以了解转印至膜上的总蛋白质的组成情况,并可确定蛋白质分子质量标记物的位置和确定转印成功,同时,该方法也清楚地显示出转印蛋白质的复杂性.丽春红 S 印迹膜染色法：丽春红 S 适用于酸性水溶液,染色但是不持久,在后续的处理中红色染料易被洗去,由于与蛋白质的结合是可逆性的,该染色方法适用于所有显示抗原的饿技术, 丽春红 S 带负电荷,可以与带正电贺的氨基酸残基结合,同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合,从而形成红色条带.1)丽春红溶液的配制:储存液(10)： 0.1g 丽春红溶于 5ml 冰乙酸,加入 H2O 定容至 100ml,临用前稀释 10 倍为应用液.2)操作步骤

38、转印 结束后取出印迹膜至于丽春红 S 应用液中,并在室温下 搅动 5-10 分钟将膜放入 PBS 洗数次,每次 1-2 分钟,并且更换 PBS根据需要将转印部位和分子量标准位置进行标记至此膜可以用于封闭和加入抗体六、膜的封闭在进行抗体杂交之前，需要先 对转印膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，常用的有 0.2%Tween-20，20%BSA，10%马血清以及 5% No-fat milk 等，至于 选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测试剂相适应，如采用葡萄球蛋白A（SPA）作用检测试剂，就不能用全血清封闭，其次是尽可能使非特异着色背静浅，封闭液以 20%B

39、SA 效果较好，其次是 5%N-fat milk.封闭过程：1) 洗转印膜：室温漂洗 3 次 x10min,以尽量洗去转印膜上的 SDS，防止影响后面的抗体 结合。2) 取漂洗的转印膜，放入 5% No-fat milk 的封闭液内， 摇床震动，室温封 闭 2h，也可在 4 度过夜。3) 用 1xTBS-T ，PH7.6 洗液，室温漂洗 3 次 x10min.七、抗体杂交抗体表面主要采用间接法。即先加入未 标记特异性抗体（Ab1）与膜上抗原结合，再加入标记的抗抗体（Ab2）进行杂交检测 ，标记 Ab2 物质有放射性核素，酶，以及生物素等。杂交过程：）封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体稀释液稀

40、释的 Ab1 浓度为 1ug/ml，封口，4孵育过夜或室温（22-25 ）摇动孵育 2h.） 液洗膜 3 次 x10min）标记的 Ab2（羊抗兔-HRP）室温 1h，洗膜 3x10min八、检测根据标记 Ab2 的标记物不同 ,其杂交的结果检测方法也不同,较常用的检测系统有 HRP 标记 Ab2 的的增强化学发光(ECL)和 DAB 检测系统.1) 辣根过氧化物酶-DAB 法:DAB 显色液的配制:按照 1mlH2O 加显色剂 A,B,C 各 1 滴,混匀.显色 :将适量 DAB 显色液平铺在 Ab2 杂交后的印迹膜上,室温放置观察,可出现明显的棕褐色蛋白显色带终止 :用 Tris-HCl

41、缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止反应.2) 辣根过氧化物酶-ECL 法:增强化学发光(ECL)检测是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质,生成一种不稳定的中间物质,其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带,利用 X 线胶片感光原理,将结果记录下来:ECM 显色剂配制:按 mlH2O 加显色剂 A、B 各 1 滴,混匀.在暗室将杂交后印迹膜放入显色盒中,加上混合好的显色液,月 1-5 分钟用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角部分多余的显色液,将一透明的玻璃纸盖住抚平,并确定干的表面与胶片接触.将印迹膜在暗室中使胶片暴光 1-5 分钟,冲洗胶片以确定所测抗原的正确暴光时间,暴光时间可短至几秒也可以长到数小

42、时.冲洗胶片步骤:先在显影液中冲洗至胶片上出 现条带或者胶片透明为止,在放入定影液中漂洗,十秒即可.注意事项:1. 免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关.因此,凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太低,如果过低应该重新纯化和浓缩使用,或者建议做一次梯度稀释,上样电泳后,直接考马斯亮蓝染色选择最佳上样量,纯化和浓缩的蛋白质样品必须注意盐的浓度过高,可平衡一下盐的浓度,如,透析.2. 形成凝胶的试剂要有足够的纯度,激活剂的浓度适当,不仅可以决定凝胶聚合的速度,也将影响凝胶的质量,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度.因此,建议要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开

43、始出现凝胶凝聚的时间为 15-20 分钟最佳,对于浓缩胶最佳聚合时间为 8-10 分钟开始可见聚合.灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合.3. 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免枕头刺入胶内.4. 电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺,同时建议低电压短时间的预电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通(恒压10-20V,20-30min)5. 加样前样品应先离心

44、,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象6. 为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液7. 样品缓冲液中煮沸的样品可在-20 存放数,但是反复冻融会使蛋白质降解8. 为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印.9. 上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔10. 取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角) 转膜时也应用同样的方法对 NC 膜做上标记(如左上角) 以分清正反面和上下关系 .11. 转膜时应依次放好 NC 膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极,NC 膜对应正极.注：大蛋白和小蛋白的转膜电转移缓冲液中 S

45、DS 与甲醇的平衡、蛋白的大小、胶的浓度都会影响转膜效果，如下调整可以增加转膜效率：大蛋白（大于 100 KD）1对于大蛋白而言，其在凝胶电泳分离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此对于这种大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶， 8%或更低，但因低 浓 度的胶非常易碎，所以操作时需十分小心，2 大蛋白易在凝胶里形成聚集沉淀，因此； 转膜时在电转 移缓冲液加入终浓度为 0.1%的SDS，以避免出现这种情况，甲醇易便 SDS 从蛋白上脱失，因此应降低电转移缓冲液中甲醇的浓度至 10%或更低，以防止蛋白沉淀。3 降低电转移缓冲液中甲醇的比例以促进凝胶的膨胀，易于大蛋白的转出。4 如果使用硝酸纤维素膜，甲醇

46、是必需的，但如果是 PVDF 膜，甲醇可以不必加入电转移缓冲液中，但转膜前 PVDF 需用甲醇活化。5 选择湿式，4转膜过夜，以取代半干式 转膜。小蛋白（小于 100 KD）1 SDS 妨碍蛋白与膜的结合，特 别是对小蛋白更是如此，因此，对于小分子的蛋白，电转移缓冲液中可以不加 SDS。2 保持 20%的甲醇浓度，对于大于 500KD 的蛋白， 请参考下述文献： Bolt and Mahoney, High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfatepolyacrylamid

47、e, gel electrophoresis. Analytical Biochemistry 247, 185192 (1997).更多的转膜注意事项： 避免用直接接触膜，应使用 镊子，手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生背景污斑 排列三明治时，尽量用移液器或 15ml 试管赶除胶与膜之间的气泡，或将三明治放在装有的培养皿中以防止气泡产生， 请戴手套！ 确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同，否 刚导致电流不能通过膜，从而转膜无效 鸡抗体易于与 PVDF 膜和其它尼龙膜结合， 导致高背景，请替换成硝酸纤维素膜以降低背景。C-3 膜上蛋白的检测：丽春红为检测转膜是否成功，可用丽 春红染色，2%的

48、丽春红贮备液(20ML) ：: 2%丽春红(0.4 克)溶于 30%三 氯乙酸(6 克)和 30%磺基水杨酸(6克)丽春红染色工作液：2%的丽春 红贮备液 1：10 稀释，即加 9 倍的 ddH2O染色方法：将膜放入 TBST 洗一次，再置于丽春红染色工作液中,在室温下 摇动染色 5 分钟，大量的水洗膜直至水变清无色蛋白条带清晰，（膜也可以用 TBST 或水重新洗后再 进行染色）PVDF 膜需用甲醇再活化后用 TBST 洗后 进行封闭。10x TBS 的配制24.23 g Trizma HCl80.06 g NaCl加约 800 ml 超纯水用纯 HCl 调 pH 至 7.6 定容至 1 L.

49、TBST 的配制配制 1 L TBST：: 量取 100 ml 10x TBS + 900 超纯水 + 1ml Tween20Tween20 非常粘稠，用枪头不易吸取，请确定加入准确的量，最好用 Tris buffer.配成 10%的Tween20 母液后使用。常见问题分析与解决方案问题 可能原因 验证或解决办法封闭不充分延长封闭时间，更换合适的封闭剂（脱脂奶粉， BSA，血清等）一抗浓度过高 增加一抗稀释倍数,抗体孵育温度过高 4孵育二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度一抗或二抗与封闭剂有交叉反应在孵育和洗涤液中加入 Tween-20 以减少交叉反应.洗膜不充分 增加洗涤次数膜不合适 NC 膜比 PVDF 膜背景低背景高膜干燥 保证充分的反应液，避免出现 干膜现象一抗、二抗等不匹配订购试剂时认真选取一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之 间相匹配的抗体及底物。可通过设置内参可以 验证二级检测系统的有效性。一抗或/和二抗浓度低 增加抗体浓度，延长孵育时间封闭剂与一抗