1、1如 何 采 用 多 条 溶 出 曲 线 “剖 析 ”口 服 固 体 制 剂 内 在 品 质谢 沐 风上 海 市 食 品 药 品 检 验 所 上 海 市 浦 东 新 区 张 衡 路 1500 号 邮 编 ：201203Email: 单 位 电 话 ：021-38839900-26865手 机 ：13764153662 传 真 ：021-50798189摘要 溶出度试验技术在近十年间取得了飞速发展，对其应用与理解在最初为建立体内外相关性的基础上，又有了更为深入的认知与拓展；尤其对于口服固体制剂的质量评价，愈发显现出其举足轻重的作用。本文将着重阐述采用多条溶出曲线剖析固体制剂内在品质的具体试验步
2、骤与操作细节，寄望能对我国固体制剂内在品质的认识与提高有所启迪和贡献。关键词 溶出度 剖析 固体制剂 内在品质溶出度试验技术作为“评价固体制剂内在品质的灵魂与核心”，随着人们对该项技术的不断研究与深入，对其认识与理解亦在不断 发展与变化着。现今， 该试验不仅具有为建立体内外相关性而设立的宗旨，且还 已成为证明药物体内释放特性的一种 简单、廉价而不失严谨的实验室检测方法。尤其、 “在多种 pH 值溶出介质中溶出曲 线的测定”更是成为“剖析”和“肢解”原研固体制剂内在品质的一种擘肌分理、抽 丝剥茧的重要手段；成 为固体制剂内在品质呈现于外在表象的一种“映射”与“载体”。所以，该试验可在 评 估不同
3、来源的同一制剂内在品质差异性方面发挥出重要作用。日本自 1998 年开始实施“药品品质再评价工程”以来 1，陆续出版了医療用医薬品品質情報集（即日本参比制剂目录、橙皮书、 Orange book），其中详细罗列了所收载制剂的四条标准溶出曲线。美国 FDA 药品审评中心的仿制药办 公室属下的生物等效部也于 2004 年 1 月起，在其官方网站上推出了“固体制剂溶出曲线数据库” 2。我国截止目前虽未推出“溶出曲线数据库”，但对于固体制剂多条溶出曲线的测定愈发受到瞩目与重视。本文在参照了国 际药物联合会（FIP）颁布的口服固体制剂溶出度试验指导原则 3、日本厚生劳动省颁布的仿制药生物等效性试验指导原
4、则 4、美国食品药品监督管理局颁布的常规口服固体制剂溶出度试验工业指南 5、美国药典溶出度试验验证法：研究与建立 6和欧洲药典溶出度 试验法 7基础上，详细阐 述了如何采用多条溶出曲 线剖析固体制2剂内在品质的具体试验步骤，寄望能通过此种检测手段找到我国产固体制剂与进口原研制剂内在品质上的差距，从而为临床上的疗效差异提供有力佐证，为国家相关技术法规的拟定与完善、为企业如何切实有效地提高药品质量提供依据、奠定基础 8,9！1. 原研制剂（亦称参比制剂）的确认由于我国绝大多数药物皆为仿制药，故在进行其内在质量评价时，一定要明确是与原研制剂相比较，且溶出曲线的比 对应是以原研制剂为“蓝本 ”进行的。
5、所以， 试验前一定要获得原研制剂，以其作为参比制剂进 行测定。由于原研制剂一般皆为国际大制药公司研制，且在生产过程中皆严格执行了 GMP 标准；同时、在 该产品的研发与其后的质量控制阶段皆予以了针对性的制御，故其产品的均一性和稳定性毋庸置疑。因此，对于参比制剂的遴选，本应 从多批号样品中撷取出一“标准批号”，但考虑到工作量和以上因素， 获取一个在有效期内批号的样品即可。2. 采用多条溶出曲线剖析参比制剂2.1 溶出介质的选择2.1.1 对于普通制 剂(1)酸性药物制剂 pH 值分别为 1.0 或 1.2、5.56.5、6.87.5 和水；(2)中性或碱性药物/包衣制剂 pH 值分别为 1.0
6、或 1.2、3.05.0、6.8 和水；(3)难溶性药物制剂 pH 值分别为 1.0 或 1.2、4.04.5、6.8 和水；(4)肠溶制剂 pH 值分别为 1.0 或 1.2、6.0、6.8 和水；2.1.2 对于缓 （控）释制剂pH 值分 别为 1.0 或 1.2、3.05.0、 6.87.5 和水。2.1.3 讨论与 说明(1) 药物 pKa 值小于 3.0 的可看作酸性药物，大于等于 3.0 的可看作中/ 碱性药物。(2) 在进行溶出曲线测定之前，应首先测定主成分在各种溶出介 质中的溶解度，以知 晓和预知该制剂是否为“pH 值依赖性制剂”。日本橙皮书中收载有这些数据。(3) 试验前还应
7、进行原料药在各 pH 值溶出介质中的稳定性考察，以确保试验数据的准确测3定。日本橙皮书中收载有该部分内容。(4) 以上 pH 值之所以给出范围或选项，系因各国要求不同所致，研究者可酌情予以考 虑。(5) 以上含有 pH 值范围的，可分别按 0.5 或 1.0 间隔测试，如溶出曲线差异较大，应分别予以关注；如无明显差异，酌情选择即可。美国一般采用 1.0、4.5、6.8 和水、而日本一般采用 1.2、4.0、6.8 和水四种介 质。(6) 无论何种制剂都不建议采用 pH8.0 以上的介质进行表达；如确有必要，应提供充足理由。FDA 公布的溶出度数据库中，有“阿维 A 胶囊”采用 pH9.6 溶出
8、介质的特例。(7) 以前人们在进行溶出度研究时， 为模拟人体胃液与 肠液， 还有意识地研究在“含有胃蛋白酶的模拟胃液”和“含有胰酶的模拟肠液”中的溶出情况。含有胃蛋白 酶 的模 拟 胃液，英文全称 为 Simulated Gastric Fluid，简 写 为 SGF。有 时 亦可附有下 标“sp”，缩 写 为 SGFsp。其配制方法 【中国 药 典 】 取稀 盐 酸 16.4ml（相当于 盐 酸 3.84ml），加水 约 800ml 与胃蛋白 酶 10g，摇 匀后，加水稀释 成 1000ml，即得。【美国 药 典 】 取 2.0 氯 化 钠 和 3.2g 胃蛋白 酶 （标识应为 每 mg 中
9、含 8002500 个活度 单 位），加 7.0ml盐 酸和水使溶解至 1000ml，即得。 该 溶液 pH 值应为 1.2。含有胰 酶 的模 拟肠 液，英文全称 为 Simulated Intestinal Fluid，简 写 为 SIF。有 时 亦可附有下 标 “sp”，缩 写 为 SIFsp。其配制方法 【中国 药 典 】 取磷酸二 氢钾 6.8g，加水 500ml 使溶解，用 0.1mol/L 氢 氧化 钠 溶液 调节 pH 值 至 6.8；另取胰 酶 10g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀 释 至 1000ml，即得。【美国 药 典 】 取磷酸二 氢钾 6.8g，加水 250m
10、l 使溶解，加 0.2mol/L 氢 氧化 钠 溶液 77ml 和 500ml 水，再加胰 酶 10g 使溶解后，用 0.2mol/L 氢 氧化 钠 溶液或 0.2mol/L 盐 酸溶液 调节 pH 值 至 6.80.1，再加水稀 释 至 1000ml，即得。现今，鉴于所取用的酶给测定结果带来的不确定性与不稳定性，已基本上取消这种研究；取而代之的是使用该配制法，但不含有其中酶。如 FDA 公布的溶出度数据库中，就有数个品种采用了“SGF(SIF) without enzyme”。但对于附有明胶交联的制剂，由于此类制剂的生物利用度与交联度呈正相关，在溶出介质中加入适量酶可有效评价交联胶囊的溶出度
11、，因此在研究时，可考虑添加酶以及酶的种类与浓度。2.2 溶出介质的配制2.2.1 欧洲药 典配制法(1) pH 值 1.02.2 盐酸溶液4pH 值 1.0：精密量取盐酸溶液 9.0ml，加水稀 释至 1000ml，摇匀，即得。其他 pH 值溶液：量取一定体积的 0.2mol/L 盐酸液（量取盐酸 18.0ml，加水稀释至1000ml，摇匀，即得），加水稀释至 200ml，摇匀，即得。pH 值 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.20.2mol/L 盐酸液 (ml) 85.0 67.2 53.2 41.4 32.4 26.0 20.4 16.2
12、13.0 10.2 7.8(2) pH 值 3.85.8 醋酸盐缓冲液2mol/L 醋酸溶液：取 120.0g 冰醋酸（经查，冰醋酸密度为 1.049g/ml，故体积约为114ml），加水稀释至 1000ml，摇匀，即得。取下表中规定物质各量，加水溶解并稀释至 1000ml，摇匀，即得。pH 值 3.8 4.1 4.3 4.5 4.7 4.9 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.8三水醋酸钠(g) 0.67 1.5 1.99 2.99 3.59 4.34 5.08 5.23 5.61 5.76 5.98 6.232mol/L 醋酸液(ml) 22.6 19.5 17.7 14.0 11
13、.8 9.1 6.3 5.8 4.4 3.8 3.0 2.1(3) pH 值 4.58.0 磷酸盐缓冲液取 6.80g 磷酸二 氢钾，加一定体积 0.2mol/L 氢氧化 钠液（取 8.0g 氢氧化钠，加水溶解并稀释至 1000ml，即得）和适量水溶解后，再加水稀 释至 1000ml，摇匀，即得。pH 值 4.5 5.5 5.8 6.0 6.2 6.4 6.60.2mol/L 氢氧化 钠液（ml） 0 9.0 18.0 28.0 40.5 58.0 82.0pH 值 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.00.2mol/L 氢氧化 钠液（ml） 112.0 145.5 173.5
14、 195.5 212.0 222.5 230.52.2.2 美国药 典配制法(1) pH 值 1.02.2 盐酸/氯化钾溶液同欧洲药典配制法，但其中要溶解入 0.75g 氯化钾。(2) pH 值 2.24.0 盐酸/苯二甲酸氢钾溶液称取 2.04g 苯二甲酸 氢钾，加入一定体积 0.2mol/L 盐酸液和适量水溶解后，再加水稀释至 200ml，摇 匀，即得。pH 值 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.00.2mol/L 盐酸液 (ml) 49.5 42.2 35.4 28.9 22.3 15.7 10.4 6.3 2.9 0.1(3) pH 值 4.2
15、5.8 氢氧化钠/苯二甲酸氢钾溶液称取 2.04g 苯二甲酸 氢钾，加入一定体积的 0.2mol/L 氢氧化钠溶液和适量水溶解后，再加水稀释至 200ml，摇匀，即得。5pH 值 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.80.2mol/L 氢氧化 钠液（ml） 3.0 6.6 11.1 16.5 22.6 28.8 34.1 38.8 42.3(4) pH 值 5.88.0 氢氧化钠/磷酸二氢钾溶液同欧洲药典配制法。(5) pH 值 8.010.0 氢氧化钠/氯化钾/硼酸溶液称取 0.75g 氯 化钾与 0.62g 硼酸，加入一定体积的 0.2mol/L 氢氧化钠溶
16、液和适量水，溶解后再加水稀释至 200ml，摇匀，即得。pH 值 8.0 8.2 8.4 8.6 8.8 9.0 9.2 9.4 9.6 9.8 10.00.2mol/L 氢氧化 钠液（ml） 3.9 6.0 8.6 11.8 15.8 20.8 26.4 32.1 36.9 40.6 43.72.2.3 日本药 典配制法(1) pH = 1.2 溶液：取氯化钠 2.0g，加水适量使溶解，加盐酸 7ml，再加水稀 释至 1000ml，混匀，即得。(3) pH 值 3.06.0 介质 ：取十二水合磷酸氢二钠 17.91g，加水溶解并稀释至 1000mL，即得0.05mol/L 的磷酸 氢二钠溶液
17、；另取一水合柠檬酸（亦称“枸橼酸”）5.25g，加水溶解并稀释至1000mL，即得 0.025mol/L 的柠檬酸溶液。然后用柠檬酸溶液调节磷酸氢二钠溶液，使最终pH 值至目 标值即可。(3) pH = 6.8 磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钾 1.7g 和无水磷酸氢二钠 1.775g，加水适量使溶解后，定容至 1000ml，即得。2.2.4 中国药 典配制法略。2.2.5 讨论与 说明(1) 以上配制法的选取，建议根据原研制剂生产厂商的国别予以确定。(2) 以上各介质配制 pH 值误差允许范围均应在0.05 以内。2.3 溶出曲线的测定2.3.1 关于测 定时间点和结束时间点的设定6对于测定时间点
18、，普通制剂与肠溶制剂可分别为 5、10、15、20、30、45、60、90、120 分钟，此后每隔 1 小时测定；缓/控释制剂可为 15、30、45、60、90、120 分钟，3、4、5、6、8、10、12、24 小时。对于结束时间点，在酸性介质（pH 值 1.03.0）中最长测定时间为 2 小时；在其他各 pH值介质中普通制剂与肠溶制剂均为 6 小时， 缓/控释 制剂为 24 小时。但当连续两点溶出率均达 90%（缓/控 释制剂为 85%）、且差值在 5%以内时 ，试验则可提前结束。2.3.2 讨论与 说明(1) 测定时间点的拟定 为对固体制剂内在品质进行剖析与肢解，就必须“擘肌分理、抽丝剥
19、茧”般予以分析辨明。愈多的研究表明：相当一部分原研制剂的溶出曲线具有延迟、拐点等现象（如辛伐他汀片原研制剂就具有 510 分钟的延迟释放），这揭示我们在仿制研发与质量评价时应加以注意与知晓，因为这些现象对于生物等效性试验具有相当重要的意义！故以上测定时间点拟定得较为“紧凑”。但当比较时间点确定后，对于仿制制剂， 则可仅进行比较时间点的测定。(2) 用于溶出曲线比较用试验样品的生产规模 由于固体制剂生物利用度与生产规模密切相关，故一般情况下应不少于今后工业化最大生产规模的 1/10 或不少于 10 万个单位。(3) 测定数量 为达到统计学要求， 规定每个品种的测定皆应选取 12 个单位。但鉴于目
20、前溶出仪尚未有 12 个溶出杯装置，且考虑到工作量等诸 多因素，一般 测定 6 个单位即可。2.4 溶出度试验参数的确定2.4.1 装置与 转速的确定对于片剂，建议采用桨板法/50 转；对于胶囊剂、建议采用转篮法/100 转（如采用桨板法、建议采用沉降蓝），系因人 们通常认为这两者的机械强度相当，并与中老年人体内蠕 动强度基本一致。除非特指或特殊制剂，不建 议采用更慢转速。不建议采用小杯法，一并采用大杯法、体积设定为 9001000ml。如溶出样品浓度过低，可采用加大进样量至 50200l、同时加大流动相中有机相比例，使主成分峰保留时间缩短、峰形尖锐，从而提高精密度来满足测定要求。2.4.2
21、试验参数的放 宽在某溶出介质中，当结束时间点溶出量仍达不到普通制剂 90%、缓控释制剂 85%时，则可酌情放宽溶出度试验参数。建议首先采用添加表面活性剂方式，添加浓度应从 0.01(w/v)为起点、按照 1、2、5 级别逐步增加，不建 议采用 3.0%以上浓度。如仍未果，再增加转速至775100 转（片剂）或 75120 转（胶囊剂）。不允 许添加有机溶 剂促进溶出、因为这将严重背离体内外相关性原则，同时大大降低区分效应。添加表面活性剂时，应注意不同来源试剂可能会对试验结果带来显著性差异的情况，尤其是在使用十二烷基硫酸钠时。2.5 溶出曲线的测定2.5.1 测定法 10当采用紫外法测定时，由于
22、存在着辅料、胶囊壳等 诸多因素的干扰，尤其当 测定波长在短波长处时（小于 260nm），强烈建议采用两点相减法，即一波 长为主成分最大吸收波长，另一波长为远端无吸收波长，此法在日本橙皮 书中被广泛使用。该法可大大降低辅料干扰。当以上方法无法排除测定干扰，或吸收度值低于 0.25（即使采用 5cm 长距离测定池），或为提高工作效率、规避稀释 步骤时，建 议采用高效液相色谱法。 鉴于目前自动进样已较为普及，故该法与紫外法相比，具有无可比拟的优势；尤其目前超高速液相的出 现，更可实现“事半功倍”之效。以上无论采用何法测定，皆建议对照品溶液浓度配制成 50%60%释放量，以兼顾样品的高低浓度，尽可能缩
23、小外标一点法测定误差。2.5.2 样品取出后的 处理按照规定，样品取出后应予以过滤，但考 虑到滤膜吸附的影响（尤对于预经微粉化处理过的小规格难溶药物制剂，影响更甚），建议如下：(1) 如其后 为 高效液相色谱法，建议取出后勿过滤，直接离心后取上清液测定；甚至直接置于液相小瓶后静置一段时间进样亦可！如此，便可每次取样时仅量取 2ml；由于体积相对于整体的 9001000ml 甚小，故可省略掉其后的结果累积校正。(2) 如其后为紫外法测定，由于每一 时间点均应至少弃去 5ml 初滤液，故抽取体积应不少于10ml。由于体积较大，则应进 行结果累积校正，否则不利于正确判断。2.6 累积释放度校正计算公
24、式多次取样时、可采取及时补充同体积同温度溶出介质亦可采取不补液两种方式，但必须保证每次抽取体积的固定性。累 积校正计算公式如下：2.6.1 补液时8%10/)(/(%)2112 VLCLCn出出其中 Cn为各时间点取出后的 样品浓度（即稀释前的）； L 为制剂标示量（ 单位需与 Cn 一致）2LV1为各时间点固定取 样体积； V2为溶出介质体积；该公式如采用各时间点测得释放量表示，则可演变为： 211)(%) VAAn出出其中 An为各时间点测得释放量2.6.2 不补液 时 %10)()1() 212 LVCVnCnn出出其中 Cn为各时间点取出后的 样品浓度（即稀释前的）； L 为制剂标示量
25、（ 单位需与 Cn 一致）2V1为各时间点固定取 样体积； V2为溶出介质体积；2.7 溶出曲线比较法(1) 参比制剂 15 分钟内溶出量达 85%以上（50 转时）， 则无需进行曲线比较。此时、仿制制剂亦应满足此条件。(2) 参比制剂在 1530 分钟内溶出量达 85%以上时 即可采用 f2 因子比较（比较 5 或10、15、30 分 钟三个时间点），又可采用直接比较法：对应于参比制剂平均溶出量分别为60和 85两个时间点，两者平均溶出量差均在 15%范围内。(3) 参比制剂在 30 分钟后达 85%以上时 建议采用 f1 和 f2 因子比较法。 n)(1050logi2tTR2fRt 和
26、Tt 分别表示两制剂在第 n 个取样点的平均累积溶出率。当用于不同来源制剂间比较时， 1 因子应介于 015 间、 2 因子应50；当用于同一来源制剂间比较时（批间/批内差异、各种变更等）， 2 因子 应65 。下表提供了溶出量平均差异与相应 2 因子 临界值的关系。9溶出量平均差异与相应 2 因子临界值关系表比较时间点溶出量平均差异 2% 5% 10% 15% 20%2 因子临界值 83 65 50 41 36由此可见，若直观评估、各时间点差异在 10%或 5%以内， 则可基本断定 2 因子大于 50或大于 65。计算 2 因子时，时间 点的选择规定：溶出量在 85%（调释制剂 80%以上）
27、以上的时间点仅能选取一个；且由于所采用的相似因子比较法 f2 因子法计算结果有依赖于比较时间点个数的特性，故建议选取溶出量间隔相近的 34 个（普通制 剂）或 46 个（缓控释制剂）时间 点进行计算比较，但这些时间点的间隔无需相等。如按照“2.4.2 试验参数的放宽”项下试验后，最终溶出量仍未达到普通制剂 90%、缓控释制剂 85%时 ，不建议再采用更为极端的条件。此时，依据最终测定结果， 选取溶出量间隔相近的 4 个时间 点计算比较 ，即可。2.8 对于所选时间点溶出结果变异系数的规定以上所选用的第一时间点溶出结果变异系数(RSD)应不得过 20%，自第二时间点至最后时间点溶出结果变异系数(
28、RSD)均应不得过 10%。若超出， 应从仪器的适用性予以考虑解决，如增加转速或增加表面活性剂浓度，直至 满足精密度要求。3. 测定仿制制 剂通过以上对参比制剂的测定，确立“溶出曲线测定时间点”后，在这些时间点分别测定仿制制剂。仿制制剂的含量与参比制剂的差值应在 5%以内，且所 选用的样品应在重量/ 装量差异所规定范围的 1/2 以内，以尽可能排除因个体差异给溶出度试验数据带来的影响。其生产规模亦应同参比制剂。如所选时间点的溶出结果变异系数超出规定，已说明该厂家产品批内差异的低劣性，此时则无需再进行批间差异比较，但仍计算出均值用于与参比制剂的比较。4. 综合讨论与说明溶出曲线比较时，有时会出现
29、仿制制剂溶出曲线明显高于（或快于）原研制剂，这并能说明仿制制剂质量优于原研制剂，因为这同样会出现生物利用度不等效 现象！研发仿制制剂的宗旨就是要“仿得与原研制剂一致”。10参考文献1. 谢沐风 评“日本药品品质再评价工程”有感 国家药品 审评中心药品技术审评论坛 2005,3（总第9 期）2. 谢沐风、张启明等 国外药 政部门采用溶出曲线评价口服固体制 剂内在品质的情况简介 中国药事-2008.22(3).257-2613. 国际药物联合会（FIP）颁布的guidelines for dissolution testing of solid oral products4. 谢沐风 日本仿制药生
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