1、第二章 蛋白质化学 protein chemistry,第一节 通 论,一、蛋白质研究的历史及化学概念 18世纪中叶，Beccari从面粉中能分离到一种粘性很高的物质(谷蛋白)。而后的研究证明，应用稀酸、稀碱、盐类都可从植物，动物组织中分离到类似的物质。 19世纪中期，荷兰化学家GJMulder从动、植物组织中也得到了这种物质，并命名为“protein”(取自希腊文proteios，即“第一重要”的意思)，中文译为蛋白质。,二、蛋白质的分类 1. 根据分子形状（对称程度）分类 （1）球状蛋白质 如血红蛋白、肌红蛋白 （2）纤维状蛋白质 如胶原蛋白、角蛋白 2. 根据功能分类 （1）酶类：起催化
2、作用的蛋白 （2）结构蛋白类：微管蛋白，肌动蛋白 （3）转运蛋白类： （4）调节蛋白类 （5）信号传递蛋白类 （6）动力蛋白类（motor protein）,3.根据组成分类 （1）简单蛋白质 只由氨基酸组成，其水解产物全部为氨基酸。可再分为7类： （2）结合蛋白质简单蛋白质 + 非蛋白质组分(辅基)可再分为6类: 4.根据营养价值不同分类 （1）完全蛋白质 （2）不完全蛋白质,简单蛋白质分类,结合蛋白质分类,三、蛋白质的元素组成 含C（50-55）、H（6.9-7.7）、O（21-24）、N（15-17.6）， 多数含S（0.3-2.3），有些含P（0.4-0.9）（酪蛋白）及Fe（0.4-
3、0.9）（肝脏）、I（甲状腺球蛋白）、Cu、Mn、Zn等。 元素组成上的显著特点：含N量较高，且恒定（为16%左右）蛋白质含量%=含氮量6.25,第二节 蛋白质的组成单位氨基酸,一、氨基酸的一般结构特征 氨基酸：含有a-氨基的羧酸。组成蛋白质的常见氨基酸(基本氨基酸)有20种。 氨基酸的结构通式：,共同特点： 除脯氨酸外，在a-C上皆有一个氨基，故称a-氨基酸； 均为L-氨基酸。,氨基酸的D型和L型是与甘油醛相比较而得。通常把含C基团放在纵轴上，看H的位置，左边为D型，右边为L型。,二、氨基酸的分类和结构 1.根据氨基酸的化学结构分为脂肪族，芳香族和杂环族三类。 2.根据氨基酸的R基极性分为：
4、 非极性R基氨基酸，不带电荷极性氨基酸，带电荷极性氨基酸 3.根据氨基酸分子中所含氨基和羧基数目的不同分：中性、碱性、酸性氨基酸 4.根据氨基酸的R基物理性质，与水的相互作用分为： 疏水氨基酸，亲水氨基酸,疏水氨基酸：Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Phe, Trp 亲水氨基酸：Asp, Glu, Lys, Arg, His His是唯一一个R基的pKa值在7附近的氨基酸。所以具有重要的生理功能。,三、蛋白质中的修饰性氨基酸是蛋白质多肽链在合成过程或合成后由遗传编码的氨基酸经酶法修饰而来的。新发现2种由RNA编码的氨基酸。,四、非蛋白质氨基酸（天然氨基酸） 150多
5、种，可游离存在。a-氨基酸的衍生物，或b-,g-,d-氨基酸，以及D型氨基酸。 往往是某些代谢前体或代谢的中产物。,鸟氨酸,瓜氨酸,五、氨基酸的一般性质1.能结晶，晶形多种多样2.熔点高(200)3.味道各异4.除Gly外，均有旋光性5.各种氨基酸在水中的溶解度差异大 6.可见光区无光吸收，Phe（259nm）、Tyr（275nm）、Trp（279nm）有紫外吸收,五、氨基酸的化学性质 （一）两性性质和等电点 1.氨基酸在水溶液中的存在形式：两性离子形式 2.氨基酸的两性性质：氨基酸分子既含有羧基，又含有氨基，既起酸的作用又起碱的作用。,3.氨基酸的解离与等电点以Gly为例,在一定的pH值时，
6、氨基酸分子中所带的正电荷和负电荷相同，即净电荷为零，此时的溶液pH值称为氨基酸的等电点。（pI),甘氨酸的NaOH滴定曲线,根据质量作用定理: GlyH+ Gly-H+ K1= K2= Gly + GlyGly-K1 K2= H+2 Gly+在等电点时, Gly-=Gly+故 K1 K2= H+2H+=(K1 K2)1/2令I代表等电点时的质子浓度,则I=(K1 K2)1/2两边取负对数 pI=(p K1+ p K2)/2 所以Gly的等电点为:pI=(2.34+9.60)/2= 5.97,等电点与离子浓度无关，其值由两性离子两侧的可解离基团的pK值决定。,根据Handerson-Hassel
7、balch公式：,可以计算出某一pH时氨基酸各种离子的比例。 pHpI时，氨基酸带净负电荷 pHpI时，氨基酸带净正电荷 在一定pH范围内，氨基酸溶液的pH值离等电点越远，氨基酸所携带的净电荷越大。,Leu: pK1=2.36, pK2=9.60,pI=5.98 Glu: pK1=2.19,pK2=9.67, pKR=4.25, pI=3.22 His: pK1=1.82, pK2=9.17, pKR=6,pI=7.59,（二）由氨基和羧基共同参加的化学性质 1.茚三酮反应(ninhydrin reaction),(1)一般氨基酸生成蓝紫色化合物，在570nm有最大吸收 (2)Gln和Asn产
8、物为棕色 (3)Pro产物为黄色，在440nm有最大吸收2.离子交换反应：在一定pH条件下，不同氨基酸所带的净电荷不同，与离子交换树脂的结合的能力不同,（三）氨基参加的反应： 1.成盐作用 2.亚硝酸反应：是Van Slyke法测定氨基氮的基础,3.甲醛反应：室温，中性4.与2,4-二硝基氟苯(DNFP)的反应：由F.Sanger发现,5.与苯异硫氰酸(PITC)的反应：6.与5-二甲基-1-萘磺酰氯(DNS-Cl)的反应：,苯乙内酰 硫脲氨基酸,（四）羧基参加的反应： 1.成盐和成酯反应 2.脱羧基反应 3.成酰氯反应（五）侧链的反应： 1.米伦（Millon)反应单酚及双酚和吲哚衍生物能与
9、Millon试剂(硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物)产生颜色反应。(1)单酚衍生物(如Tyr)粉红色至暗红色。(2)双酚和吲哚衍生物(如Trp)黄色至红色。,2.Folin-酚反应与蛋白质中的Tyr作用。蛋白质含Tyr，其酚羟基将Folin-酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（钼蓝及钨蓝）。 3.坂口反应(Sakoguchi reaction) Arg与碱性次溴酸钠、-萘酚反应生成红色产物。 4.Pauly反应 His,Tyr与对氨基苯磺酸的重氮盐反应生成橘红色产物。 5.乙醛酸反应(glyoxalate) Trp与乙醛酸和浓硫酸反应生成紫红色物。 6.Cys反应：Cys可与亚硝酸
10、铁氰化钠的甲醇溶液反应生成红色化合物,第三节 蛋白质的结构,20世纪50年代初，Linderstron-Long提出蛋白质具有几种结构层次：一级结构 基本结构二级结构三级结构 空间结构(高级结构、构象）四级结构,蛋白质的四个结构层次：,一、蛋白质的一级结构 1.一级结构的概念 指蛋白质肽链中氨基酸的排列顺序。又称共价结构或化学结构。氨基酸之间通过肽键连接起来。,2肽键和肽链 （1）1902年，Hofmeister和 Fischer 分别提出，肽键是蛋白质中氨基酸残基之间的主要连接方式：由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而成。,(2)蛋白质中肽键存在的证据：蛋白质双缩脲反应： 游
11、离氨基和羧基的数量少 1902年，Fischer人工合成的18肽可被蛋白酶水解 (3)肽：一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基之间脱水相互连接形成的化合物称为肽 (4)由个氨基酸组成的肽为二肽，个氨基酸组成的肽为三肽，以此类推 (5)寡肽与多肽：个氨基酸残基为寡肽 个氨基酸残基为多肽,（6）肽链的主链、侧链与氨基酸残基侧链基团维持蛋白质结构，行使蛋白质功能。,例外：谷胱甘肽分子是由谷氨酸的-羧基和半胱氨酸的-氨基缩合而成的。优点：肽键稳定，不易被蛋白酶水解。,3肽的命名及结构 (1)命名：从肽链的自由氨基末端（N端）残基开始，称为某氨基酰氨基酰某氨基酸。或者根据其功能和来源命名，如脑啡肽
12、(2)结构：开链式和环状结构 4.肽链表达式书写时一般肽链的自由氨基端在左边，自由羧基端在右边。,5.一级结构研究一级结构研究包括蛋白质肽链数目，末端氨基酸的种类，氨基酸组成，氨基酸顺序和二硫键位置等。 一般步骤： 获得纯蛋白质样品（97以上），测定分子量。 测定肽链的N端和C端； （确定肽链数目） 拆开肽链，分离纯化肽链； 测定肽链的氨基酸组成； 用两种或两种以上的方法将肽链断裂，建立二组或二组以上具有不同链长的肽段； 分离纯化各肽段，测其氨基酸排列顺序； 进行重叠排列，确定肽链的一级结构。 确定S-S的位置,1）末端分析 N-末端测定 a.2,4-二硝基氟苯（FDNB）法 b.Edman降
13、解法（异硫氰酸苯酯(PITC)法） 优点:剩下的肽链是完整的,可继续测定.,c.丹磺酰氯（DNS）法 优点:DNS试剂是荧光试剂,灵敏度高100倍.,异硫氰 酸苯酯,苯氨基硫 甲酰基肽,苯乙内酰硫 脲衍生物,d.氨肽酶法注意：N末端封闭的情况（焦谷氨酰环化、 乙酰化、环状肽）, C-末端测定 a.肼解法,b.羧肽酶法： 羧肽酶A:作用于除Arg,Lys,Pro和Hyp外的所有氨基酸（ C端倒数第二个是Pro时除外） 羧肽酶B:作用于Lys和Arg（C端倒数第二个是Pro时除外）,2）肽链的拆分 非共价键肽链拆分：蛋白质变性剂（脲或盐酸胍） 二硫键的拆分 还原法: 巯基化合物（巯基乙醇，DTT）
14、还原成巯基，再用碘乙酸乙酰化保护。 氧化法：过甲酸（HCOOOH）3）肽链的完全水解和氨基酸组成的测定酸水解，但Trp被破坏，所以用甲基磺酸代替盐酸水解。 组成测定：先层析再显色或氨基酸自动分析仪,返回,磺基丙氨酸,二硫苏糖醇,过甲酸,碘乙酸 乙酰化,二硫苏糖醇,4）肽链的部分水解和肽段的分离 溴化氰（CNBr）裂解法 专一水解Met的羧基端,肽酰高丝氨酸内酯,胰蛋白酶（Trypsin）水解法,胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）水解法：作用于芳香族氨基酸（Tyr，Phe和Trp ）的C端肽键 胃蛋白酶（Pepsin）水解法:疏水性氨基酸,金黄色葡萄球菌蛋白酶（谷氨酸蛋白酶）水解法：作用于
15、Glu和Asp的C端形成的肽键 梭状芽孢杆菌蛋白酶（精氨酸蛋白酶）水解法：作用于Arg的C端形成的肽键,5）肽段的氨基酸排列顺序的测定 以Edman降解法为基础的氨基酸人工或自动测序 生物质谱(15aa.) 6）肽链中氨基酸顺序的确定 片断重叠法 7）二硫键位置的确定不断裂二硫键，酶切，测序，与上述步骤所得氨基酸顺序比较可知二硫键位置。对角线电泳 也可通过测定cDNA序列测定蛋白质的氨基酸顺序,A-B-C-D-A-E-F-C-A-G-H-F-G-B-C-A 16肽,方法一,切点A,A+BCDA+EFCA+GHFGBCA,方法二，切点D、F,AEF+ABCD+GBCA+CAGHF,A,ABCD,
16、BCDA,AEF,EFCA,CAGHF,GHFGBCA,GBCA,ABCDAEFCAGHFGBCA,返回,二、蛋白质的二级结构(Secondary structure) 1.二级结构的概念是指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。,主要的化学键： 氢键,肽单位(peptide unit)又称为肽单元，是 多肽链中从一个碳原 子到相邻碳原子之间 的结构,由Linus Pauling 和 Robert Corey于20 世 纪30年代末确定。,(1)肽单位是一个刚性平面:肽键中的CN键长（0.132nm）介于C-N 的单键长（0
17、.147nm）和双键长（0.128nm）之 间，故具有部分双键性质(40%)，不能自由旋 转肽单位的6个原子处于1个平面上肽平面。 (2)肽键的原子排列呈反式构型。 (3)相邻肽平面构成二面角：一个碳原子相连的两个肽平面，由于NC 和CC两个键为单键，肽平面可分别围绕这两 个键旋转，从而构成不同的构象。,C的二面角,2二级结构的主要类型 （1） a-螺旋 (helix)结构 1） 是一个类似棒状的结构：多肽链中各个肽平面围绕同一轴旋转,形成螺 旋结构，螺旋一圈含3.6个氨基酸残基，螺距0.54 nm。相邻两个氨基酸残基之间的轴心距0.15nm 。 2）肽链内形成氢键,维持a-螺旋 的稳定：第一
18、个氨基酸的羧基与第五个氨基酸的氨基 形成氢键，氢键环内含13个原子。 3）蛋白质多为右手螺旋。,4） 螺旋结构的影响因素：以下情形不易形成a -螺旋结构： Gly，Pro 相邻氨基酸残基带相同电荷时： Poly Lys，Poly Glu 相邻氨基酸残基有较大的侧链基团时： Ile.Ile.Ile，Leu.Leu.Leu 连续几个Ser或Thr时,羟基与氢键有强烈相吸的倾向,（2）-折叠结构(pleated sheet)： 又称为-折叠片层结构， -结构 是两条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起形成的锯齿状结构。 特点：1）所有肽键参与链间氢键的形成，氢键与肽链长轴近于垂直 2）R基分布在
19、片层上下 3）相邻氨基酸残基之间的轴心距为0.35nm。 4）有平行和反平行两种。,a -螺旋结构与-折叠结构的比较,(3)-转角结构(- turn)： 又称为-弯曲（ - bend）， -回折(-reverse)，发卡结构(hairpin structure)，U形转折 特点： 1)180o转弯;2)四个连续的氨基酸残基参与，第一氨基酸的COOH和第四个氨基酸的NH3形成氢键;3)氢键包围10个原子。(4)无规卷曲(random coil)用来阐述没有确定规律性的那部分肽链 结构。,三、纤维状蛋白质(fibrous protein)的结构纤维状蛋白质是动物体的基本支架和外保护成分。大多数不溶
20、于水，如胶原蛋白、角蛋白等。有的溶于水，如肌球蛋白、纤维蛋白原等。 1. a -角蛋白(a - keratin)的结构 特点： （1）富含疏水氨基酸（Ala,Val,Leu,Ile,Met和Phe等）(2)靠范德华力维持稳定，还有二硫键。(3)弹性较大。,原纤维,初原纤维,左手的卷曲螺旋,初原纤维,原纤维,中间纤维,烫发的生化基础,2.-角蛋白结构 丝心蛋白特点： (1)反向平行的-折叠结构堆积为多层结构，链间以氢键连接， (2)富含Gly，Ser和Ala，具有重复结构Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser； (3)片层间靠范德华力(Van der waals force)维持。,3.
21、胶原蛋白（collagen）:胶原 一般结构特征：以胶原纤维的形式存在，基本单位是原胶原蛋白分子（tropocollagen） (1)由三条左手螺旋的肽链经右手超螺旋形成。 (2)肽链含Gly-Pro-Y重复结构,Y可为Hyp或Hyl。 (3)稳定的力：1)螺旋链间的氢键;2)范德华力;3)分子内和分子间的共价键;4)有的有二硫键。,四、超二级结构（super-secondary structure）和结构域（ domain ）（一）超二级结构：1973年,由M.Rossmann提出。由若干相邻的二级结构单元间组合在一起，彼此相互作用，形成有规则、在空间上能辨认的二级结构组合体，充当三级结构的
22、构件称为超二级结构。,型,- Corner,型：,型,Rossmann fold (型),（二）结构域（ domain ） 1973年，由Wetlaufer提出。在超二级结构的基础上，多肽链进一步折叠成相对独立的三维实体称为结构域。即蛋白质（亚基）结构中明显分开的紧密球状结构区域，又称为辖区。 特点： 1.自身紧密装配，结构域之间关系松懈：铰链区（hinge region） 2.100400个氨基酸残基 3.富含Pro结构域，富含Gly结构域 4.激酶结构域，DNA结构域.,肌钙蛋白的两个结构域,五、球状蛋白质的三级结构 三级结构（tertiary structure）：包括多肽链中一切原子的
23、空间排列方式。 对于较小的蛋白质和亚基来说结构域就是蛋白质的三级结构。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链由两个或两个以上的结构域缔合成三级结构。 亲水基团多位于分子表面，疏水基团位于分子内部,肌红蛋白的三级结构： 1.主链的75%为-螺旋，有A，B，C，D，E，F，G和H8段螺旋区 2.有段非螺旋区，个Pro 3.内有袋状空穴（裂穴，gap）,稳定蛋白质三级结构的作用力： 氢键、疏水相互作用、范德华力、离子键(盐键)、配位键等,六、蛋白质的四级结构 （quaternary structure）: 四级结构：指由数条具独立的三级结构的多肽链彼此通过非共价键相互连接而成的聚合体结构。 亚单位（亚基
24、）:指在四级结构中每一个具有独立三级结构的多肽链。 寡聚蛋白（多体蛋白）：由多个亚基组成的蛋白质,第四节 蛋白质的结构与功能,一、蛋白质的一级结构决定其高级结构60年代, White和Anfinsen的牛胰核糖核酸酶复性实验.,二、蛋白质的一级结构与功能 蛋白质的功能取决于其一级结构 1物种之间蛋白质的同源性：同源蛋白质（homologous proteins）：由共同祖先蛋白分子经变异和自然选择而产生的功能相同、相关或不同，但结构上有某种相似的不同蛋白质 。不同种属的同一种蛋白质，其一级结构上有些变化，这就是所谓的种属差异。 同源蛋白质的氨基酸顺序的不变残基与可变残基,细胞色素C：细胞色素C
25、是一种存在于线粒体内膜上，与呼吸过程有关的蛋白质。 对120多个生物种属的细胞色素C的一级结构分析发现，只有28个位置上的氨基酸残基是不变残基，这些多是维持其构象所必须的残基，其他残基可随着进化而变异。 同源蛋白祖先亲缘关系愈接近，其氨基酸组成的差异愈小；亲缘关系愈远，氨基酸组成的差异愈大 。,2.一级结构相同的蛋白质的功能也相同:蛋白质一级结构的差异愈小，其功能的相似性愈大 促肾上腺皮质激素(ACTH)和促黑激素(-MSH)N端的13个氨基酸残基相同： Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val(MSH)Ser-Tyr-Ser
26、-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (ACTH) 若将ACTH分子从C-端逐渐切，仅剩下N-端的13个氨基酸，则ACTH的活性完全消失，而具有显著的-MSH的活性。,3.一级结构上的细微变化可直接影响其功能 分子病：由Linus Pauling提出.指由于基因的突变导致了蛋白质分子结构的改变或某种蛋白质的缺乏所引起的的疾病。 镰刀型红细胞贫血症的分子机制： （1）1949年，L. Pauling研究了正常血红蛋白（HbA）和镰刀型红细胞贫血症血红蛋白（HbS）的物理化学性质，发现pI(HbS)pI( HbA) （2）1954年，Vernon Ing
27、ram采用指纹分析 (fingerprinting)确定了HbS和HbA的差异：链第6位由Glu6 Val6。,正常红血球镰刀型红细胞贫血症红血球,三、蛋白质的空间结构与功能 蛋白质的构象与功能是相适应的。 1胰岛素的结构与功能 （1）含A、B两条链， A链无-螺旋， B链有-螺旋，-转角和-折叠； （2）分子内部有一疏水核心； （3）3对二硫键使不同来源的胰岛素具有相同的构象相同功能,2血红蛋白(hemoglobin,Hb)的结构与功能 不同的氨基酸序列可产生相同的构象相同功能：,（1）血红蛋白与氧的结合具有协同性：）肌红蛋白(myoglobin)与血红蛋白的一级结构不同，但构象相似：,故都
28、能携带氧，但血红蛋白是四聚体，还能运输 质子和CO。,2)饱和度(saturation)或饱和分数：Hb已结合氧的位置数与可能结合氧的位置数之比。Hb(O2)n 饱和度（Y）= Hb+Hb(O2)n,3)Hb的氧合曲线为S型，说明它与氧结合具有协同性。,4)协同性的机制：蛋白质的别构效应X射线晶体衍射分析证明：脱氧Hb四个亚基的C端都参与了盐键或氢键的形成,血红素的结构,Hb T态和R态的互变：,Hb氧合与脱氧的构象转换：,血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。,（2）二磷酸甘油酸（BPG）可降低血红蛋白与氧的亲和力: 2,3-BPG的结构,BPG的
29、产生：,葡萄糖,1, 3-BPG,3-磷酸甘油酸,2, 3-BPG,2, 3-BPG 磷酸酶（活性低）,二磷酸甘油酸变位酶,3-磷酸甘 油酸激酶,乳酸,2,3-BPG 旁 路,1967年，Reinhold Benesch和 Ruth Benesch发现，无BPG时，Hb与O2的亲和力强，BPG与Hb结合， Hb与O2的亲和力。,BPG降低Hb与氧的亲和力的机理：,（3）质子和二氧化碳促进血红蛋白释放氧:Bohr效应：1904年，Christian Bohr发现，Hb与的亲和力依赖于pH，在生理pH范围内，降低pH可使Hb的氧合曲线右移。在pH恒定的条件下，增加CO2的浓度可降低Hb与氧的亲和力
30、。,3.免疫球蛋白的结构与功能:免疫球蛋白G(IgG)： 分子量150 000。,4.蛋白质分子的修饰和多肽链局部的断裂赋予它 新的功能,胰岛素的加工,第五节 蛋白质的性质,一、蛋白质的水合作用和透析 1.蛋白质的胶体性质：(1)分子大小：1100nm(2)胶体特性：布朗运动丁道尔效应 电泳现象 2.蛋白质的水合作用：球类蛋白质分子表面有许多亲水基团，使分子表面形成水化膜（每g蛋白质可结合0.30.5g水。）,3.胶体稳定的条件：蛋白质的水化层和双电层（带同种电荷）使蛋白质胶体溶液稳定。 4.不能透过半透膜(玻璃纸、羊皮纸),二、两性性质和等电点 1.侧链基团可解离，因此蛋白质也是两性电解质。
31、 2.蛋白质的等电点(pI)：,乳球蛋白,胃蛋白酶,胰凝乳蛋白酶原,三、蛋白质的变性作用与复性 变性(denaturation)作用：蛋白质因受某些理化因素的影响，分子的空间构象破坏，从而导致其理化性质，生物学活性改变的现象称为蛋白质的变性作用。 实质：蛋白质二级结构以上的高级结构的破坏生物活性丧失。 变性作用的条件：强酸、强碱、剧烈搅拌、重金属盐类、有机溶剂、脲、胍类、超声波等。,食物蛋白质的变性：变性蛋白的溶解度降低(因疏水基团外露)，分子的不对称性增加，尤其是球蛋白。变性蛋白失去结晶能力，易被蛋白酶水解。 蛋白质的复性(renaturation)：某些蛋白质变性后可以在一定的实验条件下恢
32、复原来的空间构象，使生物学活性恢复，这个过程称为蛋白质的复性 。 蛋白质变性的可逆性与导致变性的因素、蛋白质的种类以及蛋白质分子结构改变的程度都有关系。,四、蛋白质的沉淀作用 概念：由于受到某些因素的影响, 蛋白质从溶液中析出的作用称为蛋白质的沉淀作用。 1.可逆的沉淀作用： 蛋白质发生沉淀后，若用透析等方法除去使蛋白质沉淀的因素后，可使蛋白质恢复原来的溶解状态。 盐溶作用(salting-in)：在稀盐溶液中，大多数蛋白质的溶解度增加。 盐析作用(salting out)：如果向蛋白质溶液中加人大量的盐类如硫酸铵，蛋白质的溶解度逐渐下降，以致从溶液中沉淀出来。,2.不可逆的沉淀作用 重金属盐
33、类、有机溶剂、生物碱试剂等都可使蛋白质发生沉淀，且不能用透析等方法除去沉淀剂而使蛋白质重新溶解于原来的溶剂中，这种沉淀作用称为不可逆的沉淀作用。 (1)重金属盐 在碱性条件下，蛋白质带负电，可与重金属离子如汞离子、铅离子结合，形成不溶性的重金属蛋白盐沉淀。 (2)生物碱试剂 能够沉淀蛋白质的生物碱称为生物碱试剂。如单宁酸、苦味酸等。在酸性条件下，蛋白质带正电荷，可与生物碱试剂结合而沉淀。 (3)有机溶剂 乙醇、丙酮等，可破坏水化层，降低溶液的介电常数，使蛋白质分子之间的静电作用增加而易于聚集沉淀。,第六节 蛋白质的分离纯化和测定,一、蛋白质分离纯化的一般步骤 1.材料的预处理及细胞破碎 材料必
34、须新鲜，蛋白质含量高。预制备的蛋白质如对丙酮不敏感，可先用丙酮干燥。 机械破碎法 高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 渗透破碎法 利用低渗条件使细胞溶胀而破碎。 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。 对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。,2.蛋白质的抽提: 抽提：把生物物质从生物组织中以溶解状态释放出来。 根据所要制备的蛋白质的性质，可选择合适的溶剂将蛋白质与其他杂质分开。 抽提液= 离子强度调节剂 + pH缓冲剂 + 温度效应剂 + 蛋白酶抑制剂 + 抗氧化剂 + 重金属
35、络合剂或重金属 + 增溶剂 膜蛋白的抽提:加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100等)膜结构破坏蛋白质与膜分离。 在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等以防止蛋白质的变性。,3.蛋白质粗制品的获得:等电点沉淀法：盐浓度要尽量低。 盐析法：分级盐析，常用硫酸铵（溶解度大，受温度影响小）。 有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，可与水混溶，能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低；有机溶剂本身的水合作用会破坏蛋白质表面的水化层。注意：易变性，宜低温下进行。,二、分离纯化的主要方法(一)色谱法（层析法） 1.凝胶过滤法(gel-filtration chromatography
36、)又称分子排阻色谱，分子筛色谱。 原理：利用具有网状结构的葡聚糖凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。,2.离子交换纤维素柱色谱 (1)原理： 不同蛋白质由于等电点不同，在同一pH介质中所带的电荷种类数量不同，因而与离子交换剂的亲和力不同。 (2)类型： 阳离子交换剂：羧甲基纤维素(CM-纤维素) 阴离子交换剂：二乙氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素) (3)基本方法：交换剂改型，上样，淋洗，洗脱，收集,3.亲和层析:,配基：底物，抗体，酶抑制剂等,4.疏水层析 5.吸附层析 6.高效液相色谱（HPLC),(二)电泳 1.聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide ge
37、l electrophoresis，PAGE)： 原理：聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺在加速剂N，N，N，N-四甲基乙二胺( TEMED)和催化剂过硫酸铵( AP)或核黄素的作用下，聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为PAGE。 蛋白质在PAGE时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。,2.SDSPAGE 如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入0.1%的阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。 在SDS存在下，蛋白质变性
38、，肽链伸展，SDS与蛋白质结合（每克蛋白质可结合1.4g SDS， SDS电荷量远超过蛋白质的电荷量掩盖了蛋白质之间的电荷差异），使其都带负电荷。http:/ Focusing, IEF): 利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，在电场作用下，两性电解质载体按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至等于其pI 的pH梯度处时，被浓缩成狭窄的区带。,4.双向电泳,蛋白质分离纯化的主要方法,三、蛋白质分子量的测定 1.凝胶过滤法:先绘制标准洗脱曲线 2.SDS聚
39、丙烯酰胺凝胶电泳法 3.超速离心法 4.根据化学组成确定蛋白质最低分子量如果蛋白质中所含的某一元素的量已知，则元素的原子量100 蛋白质最低分子量元素的百分含量 真实分子量最低分子量n,四、蛋白质纯度的鉴别标准 可通过电泳或层析的方法鉴定蛋白质纯度 纯度是相对的。 1.在不同pH条件下电泳，蛋白质呈现一条分离带。 2.等电聚焦电泳，蛋白质呈现一条分离带。 3.纯化后，蛋白质应保留活性。 4.在超速离心场中，蛋白质以单一的沉降速度运动。,五、蛋白质含量的测定 1.紫外吸收法 (1)A280吸收法： 原理：蛋白质分子中Tyr和Trp残基的苯环含有共轭双键，故蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在2
40、80 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(A280)与其含量呈正比关系。 特点：迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。 (1)A280和A260吸收差法：当样品不纯，尤其含有核酸时采用此法： 蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74 A260,3.Folin-酚试剂法(Lowry法) 原理：蛋白质含有两个以上的肽键(-CO-NH-)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸-磷钨酸试剂)，蛋白质-铜络合物能还原磷钼酸-磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成
41、正比。 特点：操作简便、灵敏度高，较紫外吸收法灵敏1020倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。,4.染料结合法（Bradford法） 原理：蛋白质与考马斯亮蓝G-250反应亮蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。在一定蛋白质浓度范围内，吸收强度与蛋白质含量之间线性关系。 特点：该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。 5.微量凯氏定氮法 原理：被测的蛋白质与浓硫酸共热NH4，与硫酸反应硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，硫酸铵分解出氨。用蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。,本章要求,组成元素、平均含氮量 氨基酸的分类、三字符缩写 氨基酸的理化性质 肽、肽键、多肽的概念 一级结构的概念 二级结构 超二级结构和结构域 三级结构 四级结构 蛋白质空间结构与功能的关系 蛋白质的理化性质及分离纯化,
