良好的微生物实验室操作规范.doc

1、良 好 的 微 生 物 实 验 室 操 作 规 范 简 介在 微 生 物 实 验 室 中 ， 良 好 的 实 验 室 操 作 规 范 是 基 于 很 多 原 则 ， 包 括 以 下 活 动 ：无 菌 技 术 、 培 养 基 的 控 制 、 菌 种 的 制 备 、 仪 器 设 备 的 管 理 、 细 致 的 记 录 和 数 据 的 评估 、 人 员 的 培 训 。 众 所 周 知 ， 微 生 物 测 定 数 据 的 可 变 性 、 可 靠 性 和 重 现 性 是 基 于 公认 方 法 的 使 用 和 坚 持 良 好 的 实 验 室 操 作 规 范 。微 生 物 菌 种 的 维 护生 物 样 本

2、是 最 灵 敏 (delicate)的 ,因 为 他 们 生 存 能 力 和 特 性 是 依 赖 于 适 当 的 处理 和 贮 存 。 菌 种 的 处 理 和 贮 存 的 标 准 是 使 用 者 的 实 验 室 制 定 的 ， 采 用 减 少 污 染 的 机会 和 减 少 生 长 特 性 变 更 。 小 心 一 致 的 处 理 贮 存 用 菌 种 是 微 生 物 测 试 结 果 一 致 性 的 重要 因 素 。 按 药 典 方 法 方 法 使 用 的 菌 种 应 该 取 自 国 家 菌 种 保 藏 中 心 。 可 以 包 括 冷 冻 的 、冻 干 的 、 斜 面 培 养 的 或 是 马 上 使

3、 用 的 形 式 。 在 质 量 控 制 测 试 使 用 前 应 进 行 菌 种 纯 度的 确 定 和 菌 种 的 鉴 别 。 马 上 使 用 的 菌 种 要 求 确 定 纯 度 、 鉴 别 、 接 种 体 大 小 。 鉴 定 的确 认 ， 对 通 常 用 的 实 验 室 菌 种 ， 理 想 的 是 进 行 基 因 水 平 的 分 析 （ 如 ： 使 用 合 适 的 经过 验 证 的 探 针 进 行 DNA 指 纹 ,RNA 基 因 排 序 ,PCR 光 电 导 继 电 器 ）菌 种 的 制 备 和 复 壮 应 该 参 照 供 应 商 的 说 明 书 或 采 用 己 验 证 批 准 的 方 法

4、 。 种 子 批技 术 被 推 荐 用 于 贮 备 用 菌 种 的 保 存 。从 国 家 菌 种 保 藏 中 心 得 到 的 初 始 菌 种 在 合 适 的 培 养 基 被 复 壮 、 培 养 。 部 分 的 贮备 菌 种 （ 第 一 次 接 种 或 是 传 代 ） 是 悬 浮 在 抗 冷 冻 培 养 基 中 ， 分 装 至 小 瓶 中 ， 在 零 下30或 更 低 的 温 度 下 冷 冻 ， 直 到 使 用 。 如 果 冷 冻 在 零 下 70， 或 是 冻 干 形 式 ，菌 种 可 以 持 续 的 保 存 。 这 些 冷 冻 的 贮 存 菌 种 可 以 每 月 或 每 周 接 种 用 作

5、工 作 菌 种 。 一旦 打 开 ， 制 备 了 工 作 悬 浮 液 ， 不 能 再 冷 冻 。 不 能 用 的 部 分 应 该 丢 弃 ， 以 减 少 繁 殖 能力 损 失 带 来 的 风 险 和 贮 存 污 染 带 来 的 风 险 。工 作 用 菌 种 的 接 种 量 应 该 记 录 ， 以 防 止 过 量 接 种 增 加 表 型 变 种 。 一 代 的 定 义 是从 具 有 繁 殖 能 力 的 菌 种 接 种 微 生 物 到 一 新 鲜 制 备 的 具 有 促 微 生 物 生 长 能 力 和 培 养 基 中 。 任 何 形 式 的 接 种 都 被 当 做 是 一 次 转 移 传 代 。实

6、 验 室 仪 器 的 维 护多 数 的 仪 器 （ 培 养 箱 、 水 浴 、 灭 菌 锅 ） 必 须 遵 从 标 准 验 证 程 序 包 括 安 装 确 认 、操 作 确 认 和 性 能 确 认 。 另 外 还 要 求 有 定 期 的 校 验 （ 通 常 每 年 一 次 ） 。 新 的 设备 ， 实 验 室 关 键 的 ， 应 该 根 据 QCU 批 准 的 方 案 进 行 确 认 。用 于 微 生 物 实 验 室 仪 器 （ 如 ： pH 计 和 分 光 光 度 计 ） 应 按 规 定 的 进 度 表 进 行定 期 的 校 验 和 测 试 ， 以 保 证 其 性 能 。 校 验 的 频 率

7、 和 性 能 的 确 认 是 基 于 仪 器 的 型 号 的不 同 和 能 产 生 实 验 室 数 据 的 设 备 的 重 要 程 度 的 不 同 。实 验 室 的 布 局 和 操 作实 验 室 的 布 局 和 设 计 应 考 虑 良 好 的 微 生 物 操 作 和 安 全 。 本 质 是 最 大 程 度 的 减 少微 生 物 菌 种 的 交 叉 污 染 ， 微 生 物 样 本 的 处 理 环 境 也 是 重 要 ， 因 为 环 境 也 能 引 起 也 污染 的 可 能 。一 般 情 况 下 ， 实 验 室 应 分 成 洁 净 区 、 无 菌 区 和 阳 性 室 。 如 果 可 能 ， 处 理

8、 和 培 养灭 菌 产 品 的 周 围 的 环 境 区 域 应 与 阳 性 区 完 全 分 离 。 但 是 要 将 阳 性 和 洁 净 区 完 全 分 开是 不 可 能 的 ， 那 么 有 必 要 采 取 隔 离 和 无 菌 操 作 来 减 少 可 能 的 意 外 污 染 。 这 些 隔 离 包括 ： 防 护 衣 、 清 洁 、 消 毒 程 序 和 仅 用 于 洁 净 无 菌 的 生 物 安 全 柜 。 对 于 活 的 菌 种 引 起的 溢 出 和 灾 祸 的 程 序 应 放 在 现 场 ， 所 有 相 关 技 术 人 员 进 行 上 述 方 法 的 培 训 。部 分 样 品 会 出 现 微

9、生 物 的 生 长 ， 要 求 进 一 步 分 析 来 确 定 污 染 源 。 当 发 现 有 菌 生长 ， 样 品 应 从 洁 净 区 立 即 转 入 阳 性 区 。 接 种 ， 着 色 、 菌 种 鉴 定 或 其 它 的 调 查 操 作 应在 实 验 室 的 阳 性 室 操 作 。 如 果 可 能 ， 发 现 有 菌 落 生 长 的 样 品 在 实 验 室 的 洁 净 区 是 不能 被 打 开 的 。 小 心 隔 离 污 染 的 样 品 和 原 料 将 减 少 假 阳 性 结 果 。正 在 进 行 取 样 操 作 活 动 的 人 员 不 能 进 入 阳 性 室 或 在 阳 性 室 操 作

10、处 理 除 非 特 别 小心 ， 包 括 穿 防 护 服 和 手 套 ， 退 出 后 仔 细 清 净 手 。 理 想 状 态 ， 受 权 人 员 进 行 样 品 取 样操 作 时 ， 特 别 是 无 菌 过 程 的 ， 不 能 在 阳 性 操 作 室 附 近 工 作 。 同 样 ， 所 有 微 生 物 样 品都 应 采 用 无 菌 取 样 技 术 ， 包 括 非 无 菌 样 品 的 取 样 。 如 果 可 能 ， 在 规 定 的 完 全 无 菌 的条 件 的 取 样 区 域 进 行 操 作 。要 重 点 考 虑 的 是 样 品 的 污 染 ， 它 能 导 致 假 阳 性 的 出 现 ， 除 非

11、 在 过 程 中 特 别 注 意无 菌 操 作 。 取 样 间 应 设 计 好 ， 这 要 原 料 和 辅 料 的 取 样 就 可 以 在 受 控 条 件 下 进 行 ， 包括 无 菌 衣 和 无 菌 取 样 设 备 。 对 于 公 用 系 统 的 取 样 ， 如 水 系 统 ， 在 完 全 无 菌 的 条 件 下是 不 太 可 能 的 ； 然 而 ， 当 样 品 未 采 用 无 菌 技 术 取 样 时 应 有 记 录 ， 其 可 靠 性 不 可 避 免的 下 降 。环 境 监 测 的 取 样 方 法 要 求 对 取 样 的 设 备 （ 负 载 或 未 负 载 ） 进 行 最 小 化 的 无

12、菌 处理 。 如 果 可 能 ， 在 对 取 样 环 境 进 行 取 样 时 ， 取 样 的 设 备 应 同 时 配 备 培 养 基 ， 。实 验 室 中 所 有 的 测 试 ， 对 关 键 的 测 试 操 作 ， 如 ： 最 终 剂 型 的 无 菌 测 试 ， 散 装 产品 ， 生 物 产 品 用 菌 种 培 养 ， 或 是 生 物 产 品 用 细 胞 培 养 都 应 在 受 控 的 条 件 下 进 行 ， 隔离 技 术 也 是 可 以 采 用 的 ， 无 菌 的 微 生 物 测 试 。 己 在 显 示 ， 隔 离 技 术 比 人 为 的 洁 净 区域 具 有 更 低 的 环 境 污 染 水

13、 平 ， 因 此 ， 更 能 减 少 假 阳 性 结 果 的 产 生 。 隔 离 系 统 的 验 证是 重 要 的 ， 既 能 保 证 环 境 的 完 整 又 能 防 止 假 阴 性 结 果 的 产 生 ， 假 阴 性 的 结 果 是 由 化学 消 毒 物 质 带 入 。实 验 室 记 录 的 维 护合 适 的 数 据 记 录 和 研 究 对 成 功 的 微 生 物 实 验 室 是 重 要 的 。 最 重 要 的 原 则 是 按 照SOP 规 定 操 作 ， SOP 应 是 书 面 化 的 ， 并 能 反 映 测 试 的 实 际 操 作 是 如 何 进 行 的 ，实 验 室 笔 记 本 应 能

14、 提 供 所 有 详 细 的 记 录 ， 并 保 证 记 录 的 完 整 。 实 验 室 书 写 至 少 应 包括 以 下 内 容 ：日 期 ；测 试 物 料微 生 物 测 试 人 员 名 称操 作 程 序 的 号 码记 录 测 试 的 结 果偏 差参 数 的 记 录 （ 使 用 的 设 备 ， 使 用 微 生 物 菌 种 ， 培 养 基 的 批 号 ）管 理 员 ， 第 二 个 复 核 人 签 名每 一 台 关 键 仪 器 的 使 用 都 应 在 台 帐 上 记 录 ， 所 有 都 应 根 据 SOP 的 要 求 记录 在 校 正 进 度 表 和 维 护 记 录 上 。 日 志 和 其 它

15、记 录 形 式 对 实 验 室 记 录 本 起 到 支 持 和 帮助 。 设 备 的 温 度 （ 水 浴 ， 培 养 箱 ， 灭 菌 锅 ） 应 有 记 录 并 可 以 追 踪 。己 签 发 的 SOP 及 其 版 本 应 有 清 楚 的 记 录 。 数 据 的 改 变 应 用 单 钱 划 去 并 签 上 日期 和 缩 写 。 初 始 的 数 据 不 应 抹 去 或 复 盖 。测 试 结 果 应 包 括 初 始 记 数 ， 允 许 复 核 者 根 据 最 终 结 果 重 新 计 算 。 数 据 的 分 析 方法 在 SOP 中 应 详 细 描 述 。所 有 的 实 验 室 记 录 应 存 档

16、避 免 遗 失 ， 现 场 中 应 有 正 式 的 记 录 保 存 和 查 阅 程 序 。检 验 结 果 的 解 释微 生 物 试 验 结 果 难 以 解 释 ， 因 为 下 列 原 因 ：微 生 物 是 普 遍 存 在 于 自 然 界 中 的 ， 又 存 在 于 通 常 的 环 境 污 染 ， 由 人 类 支 配 的 很多 类 型 的 特 殊 的 有 机 物 。实 验 室 分 析 人 员 在 样 品 分 析 和 操 作 中 可 能 引 入 微 生 物 污 染 。微 生 物 可 能 不 是 均 匀 的 分 布 在 样 品 和 环 境 中 。微 生 物 的 分 析 结 果 存 在 相 当 大 的

17、 可 变 性 。因 此 ， 从 预 期 结 果 中 获 得 的 微 小 的 不 同 是 没 有 多 大 意 义 的 。因 为 微 生 物 分 析 的 这 些 特 性 ， 实 验 分 析 应 非 常 小 心 以 避 免 外 来 的 污 染 ， 正 如 本章 前 面 讨 论 的 。 同 样 重 要 的 ， 从 主 要 微 生 物 观 察 考 虑 ， 结 果 必 须 要 解 释 。 不 仅 包 括假 定 污 染 的 种 类 ， 而 且 包 括 药 物 成 分 、 辅 料 或 测 试 环 境 中 存 在 的 有 机 物 。 另 外 ， 其微 生 物 的 生 长 特 性 也 应 该 考 虑 。当 出 现

18、 的 结 果 与 药 典 正 文 或 其 它 建 立 的 质 量 标 准 不 一 致 时 ， 就 应 该 进 行 调 查 。没 有 满 足 标 准 要 求 的 微 生 物 污 染 ， 通 常 有 两 个 明 显 的 原 因 ： 可 能 是 实 验 室 的 错 误 或是 实 验 环 境 产 生 无 效 的 结 果 ， 也 可 能 是 产 品 有 一 定 污 染 或 其 它 形 式 的 污 染 使 得 超 出规 定 的 标 准 或 限 度 。 另 外 一 种 情 况 ， 实 验 室 操 作 ， 在 多 数 情 况 下 ， 应 立 即 通 报 。应 该 对 围 绕 结 果 的 所 有 情 况 进 行

19、 全 面 的 评 估 。 所 有 实 验 条 件 和 因 应 充 分 考 虑 ，包 括 数 据 的 漂 移 ， 与 建 立 的 限 度 和 标 准 比 较 。 重 要 的 是 根 据 结 果 的 可 变 性 知 道 观 察的 统 计 意 义 。实 验 室 环 境 ， 对 现 场 取 样 的 保 护 装 置 ， 测 试 条 件 下 物 料 的 历 史 数 据 ， 物 料 的 种类 ， 特 别 注 意 物 料 中 微 生 物 的 存 活 和 繁 殖 在 调 查 中 应 被 考 虑 。 另 外 ， 与 实 验 员 进 行讨 论 ， 分 析 中 的 实 际 操 作 可 以 得 到 有 价 值 的 信

20、息 。 来 决 定 结 果 的 可 靠 性 和 决 定 采 取和 措 施 。 如 果 可 以 确 定 得 到 不 一 致 结 果 的 明 确 原 因 ， 那 么 应 该 采 取 纠 正 措 施 ， 并 记录 问 题 所 在 。 跟 踪 正 式 批 准 和 执 行 的 纠 正 措 施 ， 并 进 行 仔 细 的 检 查 。如 果 分 析 结 果 是 无 效 的 ， 基 于 一 个 可 指 出 的 错 误 ， 必 须 记 录 。 实 验 室 应 该 有 证实 测 试 （ 再 测 试 ） 的 SOP 规 定 ， 如 果 必 要 ， 再 取 样 。 关 于 再 取 样 ， 法 规 和 药 典没 有 给 出 分 析 结 果 调 查 的 操 作