1、BMP2，4mRNA 在BALB/c 系小鼠颅面部发育中的定位表达【关键词】 原位杂交,关键词: 骨形成蛋白;颅面部发育;原位杂交骨形成蛋白（Bone morphogenetic Proteins，BMPs）属于TGF- 超家族，最初从牛的脱矿骨骨基质提取出来，在活体内可诱导异位成骨.但近年来的研究表明，BMPs 还是生长和发育中的调控分子.为了探讨 BMPs 在颅面部发育过程中的表达、区域及变化，为进一步研究颅面部畸形（如腭裂、唇裂、牙齿发育畸形等）的发生机制打下基础，作者检测了 BMP2，4 在颅面部各组织正常发育中的表达模式.1 材料和方法1.1 材料 BALB/c 近交系孕鼠在妊娠期第
2、 14，15，16 日分别被脱椎处死，取胎鼠头部固定于 40g L-1 多聚甲醛，常规脱水包埋，作头部冠状切片.1.2 方法 质粒 pSP-65 和 Bluescript SK 分别含有 BMP2cDNA 和 BMP4cDNA片段，分别由美国基因研究所 Dr. Wozney 和得克萨斯大学JianQuan Feng 提供，采用随机物延伸法标记地高辛作为探针.石蜡切片经常规脱蜡至水及 0.1mol L-1 PBS 后，分别用0.2mol L-1 HCL 和蛋白酶 K 处理，乙醇脱水干燥.42杂交 20h后，分别用 2SSC，1SSC，buffer，buffer依次充分洗涤.羊血清封闭 30min
3、 后，滴加抗标记碱性磷酸酶地高辛抗体2h，洗涤后用显色液（buffer1000L，左旋米唑0.24mg，NBT4.5L 及 BCIP3.5L）暗处显色 2h，TE 液中止反应，常规脱水透明封片.实验对照为除去探针的空白对照及 RNase 消化对照.阳性对照为已反复证明为有阳性反应的骨肉瘤标本.2 结果 GD14，BMP2mRNA 转录的区域主要位于鼻中隔、下鼻甲、舌体等组织的未分化间充质细胞以及麦克尔软骨前体细胞中（Fig1）.在一些上皮性区域，无论是舌的上皮细胞，还是下颌突的上皮细胞中，表达 BMP2mRNA 的阳性细胞数目都很少，在牙胚中也未见 BMP2 的阳性信号，BMP4 除了在 BM
4、P2 阳性表达的区域有表达外，舌、腭、突、舌、下颌突的上皮细胞中 BMP4 也有散在的阳性着色（Fig2）.GD15，鼻中隔软骨细胞中逐渐出现 BMP2 的弱阳性信号，在一些分化较好的细胞，如成熟的舌肌细胞中，BMP2，4 均无表达.但在一些有软骨细胞形成的区域（如鼻中隔、麦克尔软骨）等处仍有 BMP2，4 的表达（Fig3）.GD16，麦克尔软骨细胞已形成，分化成熟的舌肌细胞也已构成了舌体的大部分.此时，BMP2，4 的表达量均锐减，阳性细胞着色较前明显变浅（Fig4） ，阳性信号只存在于未分化的间充质细胞中.3 讨论 近年来的研究表明，在眼、肾、肢体、面突、牙胚、骨骼、神经系统等多种组织和
5、器官的早期发育中也有 BMPs 的转录1，2 .BMPs 在胚胎发育中表达的广泛性，提示 BMP 很可能还是一种信号分子.Vainio 等3 研究表明，BMP4 在启动牙齿发育中首先表达在牙胚的上皮中，他将含有 BMP4 的缓释珠与牙胚中的间充质细胞共培养，发现原来无 BMP4mR-NA 转录的间充质细胞中出现了 BMP4 的转录.GD14-16 为颅面部各组织器官中的未分化间充质细胞由聚集、增殖向细胞分化的转变期，在此期间，未分化细胞向麦克尔软骨细胞以及舌肌细胞分化.本实验结果表明，GD14，在未分化的间充质细胞中 BMP2，4mRNA 都有表达，但只有 BMP4mRNA 在上皮细胞中表达.
6、当进入 GD15，分化的细胞中基本都无 BMPs mRNA 的表达.例如，舌肌细胞中不表达 BMP2，4mRNA，但未分化的舌肌前体细胞中仍有 BMP2，4 的表达.表明一旦细胞完成发育，BMPs 将不再起促分化作用.而在一些软骨形成区（如鼻中隔、麦克尔软骨） ，即使未分化间充质细胞向软骨细胞的分化已经完成，其中仍有 BMP2，4 的强表达，因此此时起使用的可能不仅是 BMPs 的信号传递作用，其诱骨活性也开始发挥作用.因此，BMP2 主要在发育早期起作用，而BMP4 在早期和晚期都起作用. 参考文献:1Ten Dijke p，Yamadhita H，Sampath TK.Identifica
7、tion of type Receptors for osteogenic protein-1and bone morphogenetic pro-tein-4J.J Biol Chem，1994;269（25）:16985-16988.2Dudley AT，Loyons KM，Robertson EJ.A requirement for bone morphogenetic protein-7during development of the mam-malian kidney and eye J.Genes Dev，1995;9（22）:2795-2807.3Vainio S Muller U.Inductive tissue interactions，cell signaling，and the control of kidney organogenesis J.Cell.1997;1990（6）:975-978.基金项目: 校基科研基金项目 97X144作者简介: 吕红兵（1973-） ，男（汉族） ，山西省永济市人.硕士生（导师金岩）（第四军医大学:1 口腔医学院病理科，2 基础部生物化学教研室，陕西西安 710033，3 总装备部工程兵第二研究所门诊部）编辑 王小仲收稿日期:2000-05-28作者：吕红兵，金岩，张进，刘新平，李媛，陈应伟
