1、 分离小鼠心肌细胞 Protocol实验动物：小鼠, 体重 2030g 1 急性分离心肌细胞A 实验准备 ：1）无钙台氏液：配 500mL 无钙台氏液(50mL 台氏母液+450mL 去离子水+1g 葡萄糖), 用 NAOH 调 PH， 一般在 7.357.4 之间即可，注：充氧后调 PH 值，否则充氧后 PH 下调。调 PH 值前严格校正 PH 计，小鼠心肌细胞对 PH 值特别敏感。表 1：台式母液配方mM MW g/L g/500ml (10x)NaCl 126 58.44 7.363 36.82KCl 5.4 74.55 0.403 2.02Hepes 10 238.3 2.383 11
2、.92MgCl2.6H2O 1.0 203.3 0.203 1.02NaH2PO4.2H20 0.33 156.01 0.052 0.2574CaCl2 1.8 147.03 Glucose 10 198.2注：CaCl 2, Glucose 配制时后加， （浓度 0.9M CaCl2 母液 6.616g(有水)或者 4.995g(无水)+50ml 去离子水） ，0.2ml CaCl 2 母液/100ml 无钙台氏液2）称取 5mg 胶原酶+8mg 白蛋白3）配有钙液 200ml： 即 200ml 无钙液+0.4ml CaCl2 (0.9M)。注：小鼠心肌细胞对钙浓度特别敏感，我们为了缩短心脏
3、复跳时间，减少心肌耗氧，把有钙液中钙离子浓度降到正常的浓度的 1/44) 准备器械：大弯剪刀一把，小直剪刀两把，直镊子两把，止血钳两把，弯镊子两把，纱布一块，注射器 60mL 一个，10mL 一个；手术线一团(小鼠主动脉比较细，手术线比大鼠的要细)；表面皿三个，小烧杯 50mL 三个，量筒 50mL 两个， 500mL 一个；大烧杯 500mL 一个 250mL 一个；滤纸若干！滴管 4 个, 7 号注射针头一个（尖端磨平，靠近尖端两厘米处用止血钳夹出一道深沟以便于固定主动脉时系线） 。5）KB 液配方mM MW g/LGlutamic acid (谷氨酸)70 147.13 10.3Taur
4、ine(牛黄酸)15 125.14 1.875KCl 30 74.55 2.237Hepes 10 238.3 2.383MgCl2.6H2O 0.5 203.3 0.1015Glucuse 10 198.2 1.982EGTA 0.5 380.4 0.19KH2PO4 10 136.09 1.36注：5M KOH 调 PH 值（ 7.3-7.4） ，5M KOH 配制：28g KOH 溶于 100ML 去离子水，KB 液保存在-20冰箱中保存。B 实验过程1） 、实验前准备：（1） 、准备仪器：电热恒温器（带水泵的） 、Langendorff 灌流系统。（2） 、检查氧气瓶里是否有氧气。（3
5、） 、打开恒温灌流装置的电源开关，调节电热恒温器的水温，泵出的水打入冷凝管，使通过冷凝管的灌流液保持 37的恒温。（4） 、清洁 Langendorff 管路，第一次使用先泡酸后用蒸馏水冲洗干净，以后每次使用前先用去离子水将 Langendorff 管冲洗 3 遍即可开始实验。（5） 、配制好无钙的细胞外液及有钙液，并取约 50ml 有钙液置于表面皿中后放置在冰袋上，使其温度降到 0左右；另一 50ml 有钙液置于表面皿中放入4冰箱待用（6） 、向冲洗后的 Langendorff 管中加入有钙液，用注射器轻轻吸出气泡，并向管中通入氧气。有钙液浓度降到正常浓度的 1/4，灌入大概 50ml 有钙
6、液，上面倒无钙液。（7） 、分别称取 5mg 胶原酶和 8mg 白蛋白，用约 50ml 无钙液溶解、备用。（8） 、10ml 注射器连接预备好的 7 号针头，手术线打松结待用。2） 、正式试验：（1） 、选取小鼠，称重，用 1%戊巴比妥麻醉(腹腔注射） ，麻醉剂剂量尽量小，如果无需监测心电可采用断髓法处死小鼠。不必打肝素，肝素抗凝同时对心脏也用副作用。（2） 、待 麻 醉 充 分 后 ， 迅速开胸取出心脏（取心脏时切忌用手碰到心脏，首先用小直剪刀靠近头段剪断主动脉，用另一只手持直镊子提起肺组织，从下方游离心脏） ，放到 0的有钙液中洗涤（可以轻轻的用食指按压心脏，使心脏内的血液蹦出来，同时观察
7、蹦出来的动脉孔，即主动脉） ，分离出主动脉（主动脉不能分离太长，同时去除心包膜，即周围的组织，动作要迅速，主动脉一般位于两个白色胸腺下方，主动脉上端可见其三个分支，沿分支处剪断主动脉，暴露主动脉干出口） ，用预备好的连在 10ml 注射器的 7 号针头轻轻插入主动脉，用手术线固定主动脉（使灌流针头在主动脉的根部即可，太向下或者太向上灌流效果都不好，一般在肺动脉圆锥上端） ，将 Langendorff 管上三通打开，液体流出，然后把固定心脏的 7 号针头连接到 Langendorff 管上，用有钙液灌流，同时观察肺动脉流出道是否被堵住，如果堵住立即用小剪刀剪开（同时观察液体流下的速度，调节灌流针
8、的深度）待心脏跳动几次后，加入无钙液，直至心脏停止跳动（完全停止，否则影响酶的消化，同时用拇指和食指轻轻挤压心脏感觉硬度） ，无钙液灌流时间稍微长一点比较好，停跳后 1020 分钟加入预先配好的胶原酶和白蛋白混合液（先弃掉 20mL，而后开始计时）大约 30min 心脏颜色变浅、质地变软时，煎取少许右侧心肌组织放到 KB 液中，待有细胞下来时，将剩余心肌组织取下，用剪刀轻轻剪周围组织，不要剪断，然后将组织放到 KB液中用吸管吹打，吹打时细胞下来，而组织相对保持完整形态比较好，吹打完细胞，剩余组织扔掉，心肌细胞保存在 KB 液中。稳定一小时后待用.小鼠心肌细胞消化时长大约在 3050 分钟（3）
9、 、试验结束后，用去离子水冲洗整个管路系统，防止酶残留在管路中剩余的无钙液配成有钙液！2 实验室溶液配方普通电极液（Pipette solution，in mmol/L）KCl 20, K-aspartate 110, MgCl2 1.0, HEPES 5, EGTA 10, Na2ATP 5 at pH 7.2；用KOH 调 pH 至 7.3。有钙台式液（Tyrode solution containing, in mmol/L）NaCl 126, KCl 5.4, MgCl2 1, CaCl2 1.8, NaH2PO4 0.33, glucose 10, and Hepes 10, 用 N
10、aOH 调 pH 至 7.4。3 实验过程记录电流 protocol内向整流钾通道电流记录 protocol将电压钳制于-40 mV，从-120 mV 至+50 mV，以 10 mV 为步阶，脉冲持续时间为 300 ms，可记录到内向整流钾电流。+50 mV-40 mV-120 mV瞬时外向钾通道电流记录 protocol将膜电位钳制于-50 mV，给予 1 个 100 ms 的脉冲刺激，该脉冲在-40 mV 至+50 mV，以 10 mV 递增.+50 mV -50 mV 钠通道复活动力学 protocol复活曲线：将膜电位钳制于-100 mV，去极化至-30 mV，先给 1 个 50 ms 的脉冲使通道激活后失活，间隔 5 ms100 ms，以 5 ms 递增给予第 2 个刺激，计算间隔时间与钠电流恢复程度的关系。-30 mV-100 mV
