1、XXX实验室检测中心管理体系文件作业指导书（第 A 版 第 0 次修改）文件编号：编写：审核：批准：批准日期：受控状态： 受控 非受控正副版本： 正本 副本持有者：发布日期： 实施日期：文件编号： 作业指导书第 1 页 共 12 页第 A 版 第 0 次修改标 题：农副产品中微生物的测定 颁布日期：2014 年 月 日1. 目的使微生物的测定处于受控状态，保证微生物检测结果的准确性与一致性；规范参加本项目检测工作人员的操作规程。2. 适用范围适用于农副产品中菌落总数的测定和大肠菌群的计数。3. 引用标准食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定 GB 4789.2-2010 食品安全国家
2、标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数 GB 4789.3-20104. 概述菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。大肠菌群能在 37经 24h 能发酵乳糖，产生气体，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接指出食品是否有肠道致病菌污染的可能，有利于控制肠道传染病的发生和流行。5. 菌落总数测定5.1 术语和定义5.1.1 菌落总数
3、aerobic plate count 食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。5.2 设备和材料： 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.2.1 恒温培养箱：361，3015.2.2 冰箱：255.2.3 恒温水浴箱：4615.2.4 天平：感量为 0.1g5.2.5 均质器 5.2.6 振荡器 5.2.7 无菌吸管：1mL（具 0.01mL 刻度）、10mL（具 0.1mL 刻度）或微量移液器及吸头 5.2.8 无菌锥形瓶：容量 250 mL、500 mL5.29 无菌培养皿：直径 90 mm
4、 文件编号： 作业指导书第 2 页 共 12 页第 A 版 第 0 次修改标 题：农副产品中微生物的测定 颁布日期：2014 年 月 日5.2.10 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸5.2.11 放大镜或/和菌落计数器 5.3. 培养基和试剂: 5.3.1 平板计数琼脂培养基：见附录 A 中 A.15.3.2 磷酸盐缓冲液：见附录 A 中 A.2 5.3.3 无菌生理盐水：见附录 A 中 A.35.4 检验程序报告计数各平板菌落数计算菌落总数培养每皿中加入 15ml-20ml平板计数琼脂培养基，混匀检样 25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质10 倍系列稀释选择 2-3 个
5、适宜稀释度的样品均液，各取 1ml 分别加入无菌培养皿内文件编号： 作业指导书第 3 页 共 12 页第 A 版 第 0 次修改标 题：农副产品中微生物的测定 颁布日期：2014 年 月 日5.5 操作步骤5.5.1 样品的稀释5.5.1.1 固体和半固体样品：称取 25 g 样品置盛有 225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min10000 r/min 均质 1min2min，或放入盛有 225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min2 min，制成 1:10 的样品匀液。5.5.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225
6、mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。5.5.1.3 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1mL，沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。5.5.1.4 按 5.5.1.3 操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1 次 1 mL无菌吸管或吸头。5.5.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择 2 个3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液
7、），在进行 10 倍递增稀释时，吸取 1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取 1mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。5.5.1.6 及时将 15 mL20mL 冷却至 46的平板计数琼脂培养基（可放置于 46 1恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。5.5.2 培养5.5.2.1 待琼脂凝固后，将平板翻转，361培养 48 h2 h。水产品 301培养 72 h3 h。5.5.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约 4 mL），凝固后翻转平板，按 5.5.2.1 条件进行培养
8、。5.5.3 菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。5.5.3.1 选取菌落数在 30CFU300CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30CFU的平板记录具体菌落数，大于 300CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。5.5.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以 2，代表一个平板菌落数
9、。5.5.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。5.6 结果与报告5.6.1 菌落总数的计算方法5.6.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每 g（mL）样品中菌落总数结果。文件编号： 作业指导书第 4 页 共 12 页第 A 版 第 0 次修改标 题：农副产品中微生物的测定 颁布日期：2014 年 月 日5.6.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：N =C/(n 1 +0.1n2 )d （1） 式中： N样品中菌落数； C平板（含适
10、宜范围菌落数的平板）菌落数之和； n1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d稀释因子（第一稀释度）。5.6.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。5.6.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于 30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。5.6.1.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。5.6.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU300 CFU 之间，其中一部
11、分小于 30 CFU 或大于 300 CFU 时，则以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。5.6.2 菌落总数的报告5.6.2.1 菌落数小于 100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。5.6.2.2 菌落数大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2 位数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。5.6.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。5.6.2.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。5.6.2.5 称重取样以
12、 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。6.大肠菌群计数6.1 术语和定义:6.1.1 大肠菌群 coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰阴性无芽胞杆菌。6.1.2 最可能数 most probable number，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。6.2.设备和材料：除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：6.2.1 恒温培养箱：3616.2.2 冰箱：256.2.3 恒温水浴箱：4616.2.4 天平：感量 0.1g文件编号： 作业指导书第 5 页 共 12 页第 A 版 第 0 次修改标 题：农副产品中微生物
13、的测定 颁布日期：2014 年 月 日6.2.5 均质器6.2.6 振荡器6.2.7 无菌吸管：1mL（具 0.01mL 刻度）、10mL（具 0.1mL 刻度）或微量移液器及吸头6.2.8 无菌锥形瓶：容量 500 mL6.2.9 无菌培养皿：直径 90 mm6.2.10 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸6.2.11 菌落计数器6.3 培养基和试剂：6.3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录 A 中 A.46.3.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录 A 中 A
14、.56.3.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录 A 中 A.66.3.4 磷酸盐缓冲液：见附录 A 中 A.26.3.5 无菌生理盐水：见附录 A 中 A.36.3.6 无菌 1 mol/L NaOH：见附录 A 中 A.76.3.7 无菌 1 mol/L HCl：见附录 A 中 A.8文件编号： 作业指导书第 6 页 共 12 页第 A 版 第 0 次修改标 题：农副产品中微生物的测定 颁布日期：2014 年 月 日第一法 大肠菌群 MPN 计数法6.4.检验程序：大肠菌群 MPN 计数的检验程序见图 1。选择适宜 3 个连续稀释度的样品匀
15、液，接种 LST 肉汤管产气不产气BGLB 肉汤不产气 产气10 倍系列稀释检 样25g（mL）样品+225mL 稀释液，均质361 48h2h大肠菌群阴性 大肠菌群阳性查 MPN 表报告结果361 48h2h图 1 大肠菌群 MPN 计数法检验程序6.5.操作步骤：6.5.1 样品的稀释6.5.1.1 固体和半固体样品：称取 25g 样品,放入盛有 225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min10000r/min 均质 1min2 min,或放入盛有 225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1min2 min，制成 1:10 的样品匀液。
16、6.5.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取 25mL 样品置盛有 225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。文件编号： 作业指导书第 7 页 共 12 页第 A 版 第 0 次修改标 题：农副产品中微生物的测定 颁布日期：2014 年 月 日6.5.1.3 样品匀液的 pH 值应在 6.57.5 之间，必要时分别用 1mol/L NaOH 或 1mol/L HCl 调节。6.5.1.4 用 1mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1mL，沿管壁缓缓注入 9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸
17、管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1支 1mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。6.5.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1 次，换用 1 支 1mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15min。6.5.2 初发酵试验 每个样品，选择 3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种 3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种 1mL（如接种量超过 1mL，则用双料 LST肉汤），361培养 24h2h，观察倒管内是否有气泡产生，2
18、4h2h 产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至 48h2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。6.5.3 复发酵试验 用接种环从产气的 LST 肉汤管中分别取培养物 1 环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，361培养 48h2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。6.5.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告按 6.5.3 确证的大肠菌群 LST 阳性管数，检索 MPN 表（见附录 B），报告每 g（mL）样品中大肠菌群的 MPN 值。文件编号： 作业指导书第 8 页 共 12 页第 A 版 第 0 次修改标 题：农副产品中微生物的测定 颁布日期：2014 年
19、月 日第二法 大肠菌群平板计数法6.6 检验程序：大肠菌群平板计数法的检验程序见图 2。选择适宜 2 个3 个连续稀释度的样品匀液，接种 VRBA 平板计数典型和可疑菌落BGLB 肉汤10 倍系列稀释检 样25g（mL）样品+225mL 稀释液，均质361 18h24h报告结果361 48h2h图 2 大肠菌群平板计数法检验程序6.7 操作步骤：6.7.1 样品的稀释按 6.5.1 进行。6.7.2 平板计数6.7.2.1 选取 2 个3 个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种 2 个无菌平皿，每皿 1mL。同时取1mL 生理盐水加入无菌平皿作空白对照。6.7.2.2 及时将 15mL20mL
20、冷至 46的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加 3mL4mLVRBA 覆盖平板表层。翻转平板，置于 361培养 18h24h。6.7.3 平板菌落数的选择选取菌落数在 15CFU150CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为 0.5mm 或更大。6.7.4 证实试验从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于 BGLB 肉汤管内，361 培养 24h48h，观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳
21、性。文件编号： 作业指导书第 9 页 共 12 页第 A 版 第 0 次修改标 题：农副产品中微生物的测定 颁布日期：2014 年 月 日6.7.5 大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以 6.7.3 中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每 g（mL）样品中大肠菌群数。例：10 -4样品稀释液 1mL，在 VRBA 平板上有 100 个典型和可疑菌落，挑取其中 10 个接种 BGLB 肉汤管，证实有 6 个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（ml）=6.010 5CFU/g（mL）。7.相关文件天平称量操作规程高压蒸气灭菌器操作规程恒温水浴箱操作
22、规程均质器操作规程振荡器操作规程 pH 计操作规程菌落计数器操作规程8.注意事项检验中所用玻璃器皿,如培养皿,吸管、试管、移液器的吸头等必须是完全灭菌的,并在灭菌前彻底洗涤干净,不得残留有抑菌物质。 用作样品稀释的液体,每批都要有空白对照。接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用 75酒精棉球将手擦干净。 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用 95%酒精点燃烧灼三次后使用。 接
23、种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用 75酒精棉球将手擦干净。 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用 95%酒精点燃烧灼三次后使用。 微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。 文件编号： 作业指导书第 10 页 共 12 页第 A 版 第 0 次修改标 题：农副产品中微生物的测定 颁布日期：2014 年 月 日附录 A（规范性附录）培养基和试剂A.1
24、 平板计数琼脂（plate count agar，PCA ）培养基A.1.1 成分胰蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 2.5 g 葡萄糖 1.0 g 琼 脂 15.0 g 蒸馏水 1000 mL pH 7.00.2 A.1.2 制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH。分装试管或锥形瓶，121 高压灭菌 15 min。A.2 磷酸盐缓冲液 A.2.1 成分磷酸二氢钾（KH2PO4） 34.0 g 蒸馏水 500 mL pH 7.2 A.2.2 制法贮存液：称取 34.0 g 的磷酸二氢钾溶于 500 mL 蒸馏水中，用大约 175 mL 的 1 mol/L 氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀
25、释至 1 000 mL 后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液 1.25 mL，用蒸馏水稀释至 1 000 mL，分装于适宜容器中，121 高压灭菌 15 min。A.3 无菌生理盐水 A.3.1 成分氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1 000 mL A.3.2 制法 称取 8.5氯化钠溶于 1 000 mL 蒸馏水中，121 高压灭菌 15 min。A.4 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤A.4.1 成分胰蛋白胨或胰酪胨 20.0g氯化钠 5.0g乳糖 5.0g磷酸氢二钾（K 2HPO4） 2.75g磷酸二氢钾（KH 2PO4） 2.75g月桂基硫酸钠 0.1g蒸馏水 1000mLpH 6.80.2A
26、.4.2 制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调节 pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管 10 mL。121高压灭菌 15min。文件编号： 作业指导书第 11 页 共 12 页第 A 版 第 0 次修改标 题：农副产品中微生物的测定 颁布日期：2014 年 月 日A.5 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤A.5.1 成分蛋白胨 10.0g乳糖 10.0g牛胆粉（oxgall 或 oxbile）溶液 200mL0.1%煌绿水溶液 13.3mL蒸馏水 800mLpH 7.20.1A.5.2 制法将蛋白胨、乳糖溶于约 500mL 蒸馏水中，加入牛胆粉溶液 200mL（将 20.0g 脱水牛胆粉溶于200mL
27、 蒸馏水中，调节 pH 至 7.07.5），用蒸馏水稀释到 975mL，调节 pH，再加入 0.1%煌绿水溶液 13.3mL，用蒸馏水补足到 1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121高压灭菌 15min。A.6 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）A.6.1 成分蛋白胨 7.0g酵母膏 3.0g乳糖 10.0g氯化钠 5.0g胆盐或 3 号胆盐 1.5g中性红 0.03g结晶紫 0.002g琼脂 15g18g蒸馏水 1000mLpH 7.40.1A.6.2 制法将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节 pH。煮沸 2min，将培养基冷却至4550倾注平
28、板。使用前临时制备，不得超过 3h。A.7 无菌 1 mol/L NaOHA.7.1 成分NaOH 40.0g蒸馏水 1000mLA.7.2 制法称取 40g 氢氧化钠溶于 1000mL 蒸馏水中，121高压灭菌 15min。A.8 无菌 1 mol/L HClA.8.1 成分HCl 90mL蒸馏水 1000mLA.8.2 制法移取浓盐酸 90 mL，用蒸馏水稀释至 1 000 mL，121 高压灭菌 15 min。文件编号： 作业指导书第 12 页 共 12 页第 A 版 第 0 次修改标 题：农副产品中微生物的测定 颁布日期：2014 年 月 日附录 B（规范性附录）大肠菌群最可能数（MP
29、N）检索表B.1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表每 g（mL）检样中大肠菌群最可能数（MPN）的检索见表 B.1。表 B.1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表阳性管数 95%可信限 阳性管数 95%可信限0.10 0.01 0.001 MPN 下限 上线 0.10 0.01 0.001 MPN 下限 上限0 0 0 3.0 9.5 2 2 0 21 4.5 420 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 940 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 940 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 940 2 0 6.2 1.2 18 2
30、 3 1 36 8.7 940 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 941 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 1101 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 1801 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 1801 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 2001 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 4201 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 4201 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 4201 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 42
31、02 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 4302 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 10002 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 10002 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 20002 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 41002 1 2 27 8.7 94 3 3 3 1100420 注 1：本表采用 3 个稀释度0.1g(mL)、0.01g(mL)、0.001g(mL)，每个稀释度接种 3 管。注 2：表内所列检样量如改用 1g(mL)、0.1g(mL)和 0.01g(mL)时，表内数字应相应降低 10 倍；如改用 0.01g(mL)、0.001g(mL)和 0.00001g(mL)时，则表内数字应相应增高 10 倍，其余类推。
