1、基因工程,第五节 目的基因,第五节 目的基因,目的基因：在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。 目的基因一般是结构基因，也就是能转录和翻译出多肽的基因。选用什么样的目的基因是基因工程设计必须优先考虑的问题，如何分离获得目的基因是基因工程操作的重要技术之一。,转录启动区、核糖体识别区、编码区(起译码ATG、ORF、休止码TAG或TAA或TGA)、终止转录区 （1）原核生物基因的组成 基因区：操纵子。基因之间有间隔序列 启动区：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段 SD区：起译码ATG上游约10bp处的富含嘌呤的保守区，其转录物：5AGGAGGU3，核
2、糖体16S rRNA识别、结合mRNA的位置 转录终止子和终止因子：分别指基因或操纵子3 端提供转录终止信号的DNA序列；协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形成茎环发夹 。,结构基因的组成,基因区：ATG + extrons + introns + TAA（TGA或TAG） 转录启动区：r、m、tRNA分别由RNA聚合酶、转录。编码蛋白的启动子( RNA聚合酶识别)可寻找三个保守区：-20-30的TATAA/TA区(Hogness框)：解链，决定起录点-75的9bp共有序列GGT/CCAATCT区(CAAT框)：与RNA聚合酶结合有关-75区
3、上游有一共有序列GGGCGC (GC框):结合某些转录因子 转录终止区: （3）其他基因组基因的组成质粒(无内含子) 、 病毒(重叠基因) 、线粒体(缺少 SD序列) 、叶绿体(多顺反子) 。,（2）真核生物基因的组成,一、目的基因的来源 二、获得目的基因的途径,一、目的基因的来源,目的基因主要来源于各种生物。真核生物染色体基因组，特别是人和动植物染色体基因组中蕴藏着大量的基因，是获得目的基因的主要来源。 虽然原核生物的染色体基因组比较简单，但也有几百、上千个基因，也是目的基因来源的候选者。 此外，质粒基因组、病毒(噬菌体)基因组、线粒体基因组和叶绿体基因组也有少量的基因，往往也可从中获得目的
4、基因。,二、获得目的基因的途径,根据实验需要，待分离的目的基因可能是一个基因编码区，或者包含启动子和终止子的功能基因；可能是一个完整的操纵子，或者由几个功能基因、几个操纵子聚集在一起的基因簇；也可能只是一个基因的编码序列，甚至是启动子或终止子等元件。 不同基因的大小和组成也各不相同，因此获得目的基因有多种方法。,二、获得目的基因的途径,1、目的基因的化学合成 2、PCR扩增目的基因 3、利用限制酶酶切直接分离目的基因 4、通过基因组文库分离目的基因 5、通过构建cDNA文库分离目的基因 6、获得目的基因的其他方法,1、目的基因的化学合成,现在可应用全自动DNA合成仪。 （1）要求： 1）已知目
5、的基因核苷酸序列或其对应的多肽氨基酸序列； 2）较短的DNA片段，有专一性和定向性 在基因的化学合成中，首先要合成出有一定长度的、具有特定核苷酸序列的寡核苷酸片断，然后再通过DNA连接酶的作用，使它们按照一定的顺序共价的连接起来。,1、目的基因的化学合成,（2）原理： 第一个核苷酸固定于不溶性的固相载体上, 然后按预定顺序从该核苷酸开始，以3,5-磷酸二酯键与另一核苷酸进行缩合反应（封闭非反应基团 ），其后用洗涤法除去多余的反应物和副产物, 再用同样的步骤与下一个核苷酸进行缩合反应, 如此循环将合成的寡核苷酸链从载体上洗脱下来, 解除保护基, 进一步纯化。,（3）应用范围,1）合成PCR引物
6、2）寡核苷酸探针 3）人工接头及较小的基因,DNA合成仪,（4）常用的方法,磷酸二酯法 亚磷酸三酯法 固相合成法 自动化法,化学合成法的最大优点是能按照人们的意愿合成突变基因。但有局限性，要合成较长链的 DNA分子尚有困难。随着现代科学技术的发展，基因工程操作仪器设备也不断更新。如日本Zeon公司已成功制成并出售“全自动DNA合成仪” ，精工电子工业公司的“ DNA序列仪”。目前单链DNA短片段的合成已经成为分子生物学和生物技术实验室的常规技术了。,2、PCR扩增目的基因,（1）要求 已知目的基因的全序列或其两侧序列（20bp）； 合成一对与模板DNA互补的引物； DNA片断的长度在1kb以内
7、。,2、PCR扩增目的基因,（2）原理应用RT-PCR 可扩增出cDNA。,2、PCR扩增目的基因,2、PCR扩增目的基因,（3）应用 诊断：如病毒等有异常的外源基因，肿瘤遗传病等变异基因。 合成特异基因或目的基因。 合成特异探针。,3、限制酶酶切直接分离目的基因,质粒和病毒等 DNA分子小的只有几千个碱基对，大的也不超过几十万个碱基对，编码的基因较少，可直接采用限制性内切核酸酶酶切分离法获得目的基因。,对已测定了核苷酸序列的 DNA分子，根据已知的限制性内切核酸酶识别序列只需要用相应的限制性内切核酸酶进行一次或几次酶切，就可以分离出含目的基因的 DNA片段。,3、限制酶酶切直接分离目的基因,
8、如图 所示，用BamH I 和 EcoR I酶切此质粒，就可获得目的基因。,对于已克隆在载体中的目的基因，只要根据目的基因两侧的限制性内切核酸酶识别序列，用适当的限制性内切核酸酶酶切，一次就可获得目的基因。,4、通过基因组文库分离目的基因,（1）基因组文库genomic DNA library 分离真核生物中某种DNA成分, 通常是分离供体细胞中的染色体DNA，酶切后，将这些染色体DNA片段与某种载体相接，而后转入大肠杆菌，建立包含有真核细胞染色体DNA片断的克隆株, 这种克隆株群体即为这种生物的基因组文库。,4、通过基因组文库分离目的基因,（2）特点 提供全套遗传信息, 即完整的基因组DNA
9、。 可以研究基因组中5端控制基因转录的调控序列； 内含子的分布和作用； 重复序列的数量、分布及大小。,构建基因组文库全过程,（3）,1） 分离纯化基因组DNA：提取哺乳动物细胞染色体DNA 2）制备全部基因组的DNA片断 机械断裂法：用超声波或高速搅拌DNA溶液，断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端, 插入载体之前还需要进行修饰加工，少用。 限制酶降解（鸟枪法）：过去用EcoR,现用Sau3A。断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可直接与处理过的载体连接。,（3）构建基因组文库全过程,鸟枪法（shotgun approch）：,用限制性内切酶消化给体基因组DNA，这种消化产物，不经过凝胶电
10、泳分部分离，就直接用来同载体分子作连接反应的克隆方法。,（3）构建基因组文库全过程,3） DNA片断与载体的连接包装 常用载体：粘性质粒、噬菌体、YAC 基因组DNA +粘性质粒重组DNA 转化细菌菌落 基因组DNA +噬菌体重组DNA 包装成噬菌体感染细菌噬菌斑 基因组DNA +YAC 重组DNA 转化酵母菌落 1个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和。,（4）基因组文库大小的计算,1975年，L.Clarke等提出了一种计算完整的基因组文库最低重组体所需实际克隆数（ N ）的公式：In（1P）N = In （1f） P为在基因组文库目的基因出现的几率（一般为
11、99）； f为插入的限制片断长度整个基因组DNA总长度。,（4）基因组文库大小的计算,例如：从人基因组DNA（总长度为3109bp）的文库中筛选到长约1.5kb目的基因的可能性为99，那么这个基因组文库要多大？In（10.99）N = = 9.2106In （11.51033109）,用于构建基因文库片段的产生大致有两种方法：一是用限制性内切酶完全消化基因组DNA，这个方法有两个特点。第一是假如所需的基因含有所用限制酶的识别位点，那么这一基因将被克隆在两个或数个片段中，给研究带来一定的困难。第二，一般常用的限制酶大多识别六个bp序列，切割DNA所产生的片段的平均大小相对比较小（约4kb即464
12、096bp），因此整个基因文库要含有非常大量的重组体，这样应用分子杂交法进行筛选就十分费事费时。虽然可以用限制酶进行部分消化，产生约20kb的片段，但这种方法必须掌握好酶解的条件。,用于制备基因文库的随机片段的另一种方法是采用机械随机切割。这种方法可以制备大片段的DNA（用噬菌体作载体约20kb，以cosmid作载体约45kb ），从而克服上述的两处缺点。但是这种方法的不是之处是：所制备的片段的末端顺序是随机的，还必须经过末端修复，人工制造接头等手续才能与载体进行连接。 用于基因文库构建的载体常用噬菌体或cosmid载体，因为它们的容量比较大，可克隆大片段的DNA。虽然cosmid载体比载体的
13、容量大，但由于文库的保存（cosmid载体在E.coli中， 载体在噬菌体中） 比cosmid容易，因此载体用的更多些。,有一些序列不能被克隆Example: 1. 序列缺乏酶切位点; 2.目的基因包容在一个其大小范围超出载体承载能力的DNA片断上,Too long for the vector used,5、通过构建cDNA文库分离目的基因,(1) cDNA文库(cDNA library) 某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的各种 cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌克隆子群体之中，这样的群体称为 cDNA 文库。 如果此群体中只贮存该基因组的部分 cDNA，则称为部分
14、 cDNA文库。,（2）cDNA文库的特点,cDNA无内含子, 长度较基因组基因小, 使操作更为方便。mRNA比基因组中基因少, 因此筛选某一特定功能基因工作量较小。mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利于获得较多的模板。 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白 不同种类不同状态的细胞的cDNA文库不同,（3）构建cDNA文库的全过程,1）mRNA的提取与纯化 2）第一股 cDNA合成 3）第二股cDNA的合成 4）cDNA与载体连接和导入宿主细胞 5）从cDNA文库中钓取目的基因,（3）构建cDNA文库的全过程,1）mRNA的提取与纯化 a. 取材：mRNA约占总RNA的1%5，所以应选用目的
15、基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源，如获胰岛素基因，应以胰岛细胞为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料 b. 从总的RNA中分离mRNA：将提取的mRNA在寡聚脱氧胸苷酸 oligo(dT) 纤维素中进行亲和层析。,（3）构建cDNA文库的全过程,2）第一股 cDNA合成 a. 以Oligo(dT) 为引物：从模板3末端开始，沿模板的35方向合成, 对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA b. 随机引物：以68个核苷酸为随机引物，从mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链（RNA-DNA）,3）第二股cDNA的合成 自身引导法 置换合成法 外加引
16、物合成法,方法：合成cDNA第一链5AAAAAA 3 mRNA TTTTTTT 5 cDNA 1Oligo(dT)，反转录酶d NTP, 合成cDNA第二链 AAAAAA 3 cDNA 2TTTTTTT 5RNase H，DNA聚合酶, dNTP5 AAAAAA 3 双链 cDNA 3 TTTTTTT 5,cDNA第二链合成 方法：自身引导法 第一链合成过程中形成cDNA/RNA杂交分子变性，降解RNA 单链cDNA分子的3末端自身环化，形成发夹结构 以此为引物，在DNA聚合酶作用下合成第二链,缺点：S1核酸酶,置换合成法,焦磷酸钠存在下合成cDNA的第一链 RNAaseH酶降解RNA RNA
17、链上出现切口 产生一系列带3-OH的RNA引物 大肠杆菌DNA聚合酶合成cDNA的第二链,PCR法,4）cDNA与载体连接和导入宿主细胞,5）从cDNA文库中钓取目的基因,核酸杂交法 特殊标记的寡核苷酸链为探针，将扩增好的cDNA文库（即许多带有cDNA重组体大肠杆菌培养皿内所形成的菌落或噬菌斑）转印到硝酸纤维素膜上，碱解后加带标记的探针进行杂交，能显示特异结合探针的点（克隆）便是目的基因所在处。 确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取，再用限制性酶切出cDNA基因片断，即为目的基因。,5）从cDNA文库中钓取目的基因,免疫结合法 噬菌斑转印到硝酸纤维膜上，各种cDNA表达并呈现在噬菌体表面的蛋白
18、质便牢固地结合在膜上。然后将膜放入含有特异抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗去未结合的抗体后，再与125 I 标记的第二抗体结合, 从而找出带有放射性示踪信号的斑点, 进而找出对应噬菌斑, 克隆扩增, 提取DNA后经酶切可获目的基因。,6、获得目的基因的其他方法,（1）构建差示文库筛选特殊基因差示文库（differential library）又称扣除文库（ subtracted library）, 是反映不同组织、细胞或同一种细胞在不同生理状态下，基因表达差异的cDNA文库。,（2） mRNA差异显示法获得目的基因 mRNA差异显示（mRNA differential display DD）P
19、CR法全称为DD-PCR法，其用途和应用目的与构建差示文库大体一致。,差别杂交（differential hybridization）又称差别筛选 (differential screening )适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA的cDNA。扣除杂交（subtractive hybridization ） 又叫扣除cDNA克隆（ subtractive cDNA cloning） 通过构建扣除文库得以实现。,差别杂交：需要两种不同的细胞群体（目的基因正常表达、目的基因不表达），分别制备两种不同mRNA提取物，以两种总mRNA探针平行杂交，对有表达目的基因的细胞总mRNA构建的克隆文库
20、进行筛选。,差别杂交的局限性：1.杂交灵敏度低，对于低峰度的mRNA尤为明显2.工作量大，重复性差，两套平行滤膜之间的DNA保有量有差别，导致杂交信号不一致。,扣除杂交：去除普遍共同存在的、或是非诱发产生的cDNA序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集。,减数杂交分离T细胞受体基因,应用mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）分离克隆的目的基因(differential display reverse transcription polymerase chain reaction),原理：用3 -端锚定引物和反转录酶合成cDNA的第一链；用3 -端锚定引物和5-端10-mer随机引物
21、组成引物对，以反转录第一链为模板进行PCR扩增（DDRT-PCR），在标准的序列胶中电泳23小时，可显示出50100条长度在1005000bp之间的DNA条带。,3 -锚定引物：P.Liang等人设计合成了全部12种不同的引物，用以反转录mRNA，合成第一链cDNA。这种引物通常叫作3-端锚定脱氧核苷酸引物，并用5-T11MN或5-T12MN通式表示。其中M为除了T以外的任何一种核苷酸（即A、G或C），而N则为任何一种核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12种不同的排列组合方式。 mRNA: 5-NMAAAAAAAA-3(12种序列)3-NMTTTTTTTTT-5,5-随机引物：10-mer
22、，更好的同第一链结合，从而呈现出更多种的mRNA。一般用20种随机引物和12种3-端锚定引物组成的全部240组引物对PCR扩增后，所产生的大约20 000条条带，基本涵盖了在一定的发育阶段某种类型细胞中所表达的全部的mRNA。,DDRT-PCR（mRNA differential disply reverse transcription polymerase chain reaction）由于在cDNA群体中，代表特定细胞类型或发育阶段的mRNA的含量非常低，所以要把一种只在某一阶段或某种细胞类型中表达、而在另一发育阶段或某种细胞类型中不表达的目的基因分离出来，就需要PCR扩增。,基本过程：1
23、. 从一对处于不同发育阶段（或不同基因型） 的细胞群体中分离总mRNA，并用3-端锚定引物作反转录合成第一链cDNA;2.用5-端随机引物和3-端锚定引物组成的引物对，在加入放射性同位素标记的dNTP的条件下，以第一步反转录产物作模板进行PCR扩增。3.将扩增样品在变性的DNA测序胶中进行电泳分离；,4.将有关的差别表达的DNA条带从测序胶上切割下来回收其DNA片断； 5.胶块中的DNA量非常少，不能用于克隆，需进行二次扩增； 6.将克隆的特定的DNA分别同基因组DNA及总mRNA作Southern或Northern杂交，测序； 7.以此目的片断作探针从cDNA文库中或基因组文库中筛选全长的c
24、DNA克隆或基因组克隆。,优点：1.可以同时比较多个样品表达的差异； 2.可以同时检测“上游”及“下游”的基因；3.检测灵敏度高，所需样品少，经PCR扩增一些低峰度的mRNA也可以被检测出来；4.结合使用了PCR和序列胶电泳分析两项技术，使本方法显得较单方便。,局限性：1.假阳性比例高（50%75%）；同一长度的条带，含有多种DNA序列；邻近条带回收时，造成人为误差；mRNA3-端序列保守性高，而常用3-端cDNA作探针。2.扩增的差别条带分子长度比较短小（110450bp）；,（3）基因改造可获得新型目的基因采用基因拼接、基因缺失或点突变等方法，使表达产物量提高或降低毒性，有助于研究基因间的
25、相互作用（如协同抑制效应）。,(4)构建考斯质粒基因组文库优点: 比噬菌体容纳的外源DNA大(3045kb),构建完整文库所需克隆数少; 载体仅约5kb,可直接分析插入片段的限制性图谱,而噬菌体则否.缺点 : 难筛选;重组效率低(1056-1045clongs/gDNA);不易储存.基因组文库的构建过程:酶解制备外源DNA;酶切载体;连接重组并包装进噬菌体;重组体转染宿主菌。,(5)YAC库的构建YAC（yeast artificial chromosome，酵母人工染色体）质粒载体是在人类基因组计划（HGP）实施的背景下发展起来的一类克隆特大片段的载体。这类载体含有1. 酵母菌的复制起点ARS（automatic replication sequence,ARS），2. 来自酵母染色体的着丝粒CEN（centromere）序列；3. 一对酵母的端粒TEL（telomere）序列；,4. 选择性标记和克隆位点；5. 同时还含有大肠杆菌的复制起始点，可以在大肠杆菌中以环状质粒的形式存在。DNA体外重组后以原生质体转化的方式导入酵母细胞。 这类载体克隆能力可达12Mb。主要用于基因组文库的构建。,思考题,1 什么目的基因及获得目的基因的途径有哪些。 2基因组文库、 cDNA 文库的特点及其构建过程。,重组DNA技术操作的主要步骤,目 录,
