1、壳聚糖和壳聚糖衍生物的抑菌作用摘要：壳聚糖是一类有着广谱抑菌活性的天然多糖，其生物相容性好、易降解、无毒，因而作为一种可再生资源在抑菌领域受到了越来越多的关注。本文通过对壳聚糖来源、性质、壳聚糖衍生物的化学改性的方法和抑菌作用的分析，并对今后壳聚糖衍生物抑菌情况进行了初步的展望。为研制和开发新型的高抑菌活性的壳聚糖衍生物的开发提供理论参考。关键词：壳聚糖； 衍生物；抑菌；机理引言壳聚糖是无毒、无污染，具有可再生、无毒副作用，生物相容性和降解性良好的天然氨基多糖。目前已被广泛应用于医药 12、农业 3、 食品 45等领域，并成为最近生物新材料研究的热点 67。 壳聚糖具有抗菌活性，对多种植物病原
2、细菌和真菌均抑制作用 8。但由于其不溶于水和大多数有机溶剂，只溶于稀酸，在很大程度上限制了其应用范围。壳聚糖通过化学改性，可以得到具有一定官能团的壳聚糖衍生物。与壳聚糖相比，这些衍生物的性能往往有较明显的改善。对于壳聚糖的化学修饰研究较多的有壳聚糖的酰基化、烷基化、羟基化、醛亚胺基化、硫酸酯化、羧甲基化、季铵化等，其中季铵化、羧甲基化和硫酸酯化的产物由于具有良好的水溶性而备受重视 9。有关壳聚糖的结构修饰和构效关系的研究已成为研究热点 10,因此，研究开发具有更高抗菌活性的壳聚糖衍生物，对于改善人们的生活质量具有重要意义。1 壳聚糖的来源和性质1.1 壳聚糖的来源壳聚糖是自然界唯一的碱性天然多
3、糖，壳聚糖的历史得追随到 19 世纪，当时 Rouget在甲壳素的天然聚合物中发现了其脱乙酰化的形式 11。壳聚糖是白色或淡黄色无定型、半透明、略有珍珠光泽的固体。由于其原料和制备方法的不同，其分子量也有所不同，可以从数十万到数百万不等。甲壳素在浓碱中加热处理后，就可以脱去部分乙酰基，得到壳聚糖，反应路线如下。OCH2HHOHHNHCOH3OOCH2HHOHHNH2OnnNaOHdeacetylation通常所说的壳聚糖并不是甲壳素完全脱去N-乙酰基。脱去40%以上的甲壳素就可以称之为壳聚糖 12。它的化学名称是-2-氨基-2-脱氧-(1,4)-D葡聚糖， C2有一个氨基，C3和C6分别有一个
4、羟基，结构式如图1-1。因此，甲壳素和壳聚糖的差别就在于葡萄糖的糖残基上的N-脱乙酰度。 OCH2HOHHNH2On图1-11.2 壳聚糖的性质壳聚糖不溶于水和碱性溶液，可溶于稀的有机酸(如醋酸)以及部分无机酸，如盐酸，但不溶于稀硫酸、稀硝酸、稀磷酸和草酸。壳聚糖独特的化学结构使它具有多种生物学活性，如抗菌活性 13-15、抗氧化活性 16 、免疫调剂活性 17 18、脂代谢调节作用 19、 抗肿瘤等 20。同时由于壳聚糖具有无毒、可生物降解、生物相容性好等优点，使它在生物材料、药物载体、医用及农业杀菌剂、食品保鲜、环保、兽药及饲料添加剂、保健品等领域有广阔的研究和应用前景 21-22 2 壳
5、聚糖衍生物和化学修饰方法2.1 壳聚糖衍生物由于壳聚糖在水中溶解度低，抑菌活性相对较差，因此通过化学修饰可以改进壳聚糖的溶解性和（或）增强其抑菌活性。并得到绿色环保的生物抗菌材料。对于壳聚糖的化学修饰研究较多的有氨基化 23-26、季铵化 27-28、硫酸酯化 29 、羧甲基化 30、醛亚胺基化31等，还有报道利用高碘酸等氧化断裂 2,3 位之间的 C 键产生醛基，再通过生成西弗碱对壳聚糖进行化学修饰 32。另外，通过亚连接思想，利用点击化学（click chemistry）等手段将较为复杂功能基团引入壳聚糖也有大量报道 33通过分子设计引入新的基团可提高水溶性和赋予壳聚糖新的功能性，进而生成
6、各种不同结构和不同性能的衍生物，拓宽了其应用，这对开发和应用壳聚糖具有极其重要的意义。其中季铵化、羧甲基化和硫酸酯化的产物由于具有良好的水溶性而备受重视。有关壳聚糖的结构修饰和构效关系的研究已成为研究热点。2.2 壳聚糖衍生物的化学修饰方法2.2.1 酰化反应 34 酰化反应是指在酸酐或其它酰基化合物存在条件下,在壳聚糖分子中导入不同分子量的脂肪族或芳香族酰基,在-NH2(N-酰化)上反应生成酰胺，在-OH(O-酰化)上反应生成酯的化学反。.酰化反应是壳聚糖的化学改性中研究最多的一种反应。2.2.2 烷基化反应 35 烷基化反应可以在壳聚糖的羟基 (O-烷基化),也可以在壳聚糖的氨基上(N-烷
7、基化)进行,其中主要是发生 N-烷基化反应，一般壳聚糖碱卤代烃或硫酸酯反应生成烷基化产物。2.2.3 酯化反应 29 含氧无机酸及其酸酐能够与壳聚糖分子中的羟基或氨基发生酯化反应，比较常见的酯化反应包括硫酸酯化和磷酸酯化，硫酸酯化反应一般为非均相反应,反应试剂主要有浓硫酸、氯磺酸、SO2 等;磷酸酯化. 反应一般在甲磺酸环境中与壳聚糖进行,高取代度的壳聚糖磷酸酯化物溶于水,而低取代度的则不溶。2.2.4 醚化反应 30 将碱性壳聚糖与醚化试剂反应,可制得羧烷基壳聚糖和羟烷基壳聚糖。壳聚糖碱与氯代烷基酸或乙醛酸反应,在壳聚糖的氨基上引入羧烷基基团,得到溶于水的羧烷基壳聚糖,其中研究最多的就是羧甲
8、基化反应。2.2.5 壳聚糖的季铵化 28壳聚糖通过季铵化改性不但能够提高壳聚糖衍生物的水溶性，而且生成的壳聚糖季铵盐还具有更好的抗菌抑菌性能。壳聚糖的季按化改性主要涉及直接季铵化法和接技季铵化法两种方法。壳聚糖的直接季铵化改性根据完成的途径可以分为两种：一是利用壳聚糖分子结构中的氨基与烷基化试剂作用并使伯胺基团转化为叔胺基团，然后再与卤代烃作用而在其分子链中形成季铵基团；二是通过壳聚糖的氨基先与羰基化合物作用并生成 Schiff 碱，然后再经还原生成 N-烃基化壳聚糖，最后通过与卤代烃的作用而在壳聚糖分子链中形成季铵基团。3 壳聚糖和衍生物的抑菌作用近年来，壳聚糖及其衍生物在抗细菌、抗真菌方
9、面的抑菌活性引起了广泛的重视，国内外研究者在这方面开展了大量的研究工作。3.1 对细菌的抑制作用壳聚糖对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌均有一定抑菌及杀菌作用,并且壳聚糖的稀酸水溶液对各种革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌都有一定的抑制活性，壳聚糖对微生物的抑制能力随着壳聚糖浓度升高而增强。用脱乙酰度大于等于 85%、粘均分子量小于等于47 万的壳聚糖对食品中常见细菌金黄色葡萄球菌和大肠肝菌进行定量抑菌实验,发现壳聚糖浓度达 1.0 g/L 时,其对两种供试菌的抑制率均可达 100%。Park, JH 等 36研究了壳聚糖醋酸盐对食物传播肠道致病菌的抑制作用，发现其对各种细菌的最小抑菌浓度（MIC）
10、分别是：E. coli 和 S. sonnei 为 0.08%，S. typhi 和 S. enteritidis 为 0.04-0.05%, No, HK 等从豆腐中分离并鉴定了四种细菌：Bacillus sp, B. megaterium, B. cereus, 和 Enterobacter sakazakii，并用纸片法检测了不同分子量的壳聚糖和壳寡糖对它们的抑制活性。结果发现壳聚糖的抑菌效果要好于壳寡糖，最小抑菌浓度（MIC）根据菌种的不同在 0.005%-0.1%之间 37，V. vulnificus 为到体外培养时 ,壳聚糖对能引起起慢性胃炎、消化性淸疡甚至胃癌的幽螺杆菌(Hp)也
11、存明显的抑制作用,而且相对于其他杀菌剂，壳聚糖具有抗菌谱广、杀菌率高、生物相容性好，对哺乳动物细胞毒性低等优势。Moon 等 38壳聚糖和壳寡糖对预防和治疗奶牛乳腺炎做了体内和体外实验，实验结果表明壳聚糖和壳寡糖对引起乳腺炎的致病菌之一金葡菌有显著抑制作用，并且壳聚糖和壳寡糖还对奶牛有免疫增强作用。Avadi 等 39合成了不同季钱根取代度的 N-二乙基甲基壳聚糖(/v-diethylmethylchitosan,DEMC),并研究了其对大肠杆菌的抗菌性能“研究结果显示,DEMC 的抗菌性能优于壳聚糖, 0.2-0.3 %分子量为 11 kDa 低聚壳聚糖可有效地抑制蜡样芽孢杆菌（B. cer
12、eus）在琼脂培养基上的生长。3.2 对真菌的抑制作用上个世纪八十年代科学家发现壳聚糖对真菌有抑制作用。Elghaouth 等研究了壳聚糖包衣对草莓的保护作用，发现浓度高于 1.5 mg/ml 的壳聚糖溶液就能引起植物病原真菌Botrytis cinerea 和 Rhizopus stolonifer 的形态发生变化从而产生抑制作用 40, 41。郭占勇 42等研究了壳聚糖西弗碱衍生物、N-取代衍生物和季铵盐衍生物对真菌的抑制作用，发现壳聚糖季铵盐比壳聚糖和其他衍生物有更好的抑制活性，有关通过高脱乙酰度壳聚糖的均相 N酰化反应，控制摩尔比制备一系列具有不同乙酰度而分子量相近的乙酰化壳聚糖，结果
13、表明，1.0g/L 的酰化壳聚糖对葡萄灰霉、小麦颖枯病、黄色镰刀菌和立枯丝核等 4 种植物病原真菌具有明显抗菌性，且随着乙酰基团的增加而增强，酰化壳聚糖和壳聚糖对葡萄灰霉病病菌和小麦颖枯病病菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为 0.5g/L 和 1.0g/L。3.3 抑菌作用的影响因素壳聚糖的抑菌活性已被证明和广泛报道，然而不同的报道中壳聚糖的抑菌活性却存在很大的差异，有些甚至是完全相反的结果。这些差异是因为壳聚糖的抑菌活性受分子量、浓度、脱乙酰度、pH、温度、菌株、衍生化等各方面的影响。因此，在评价壳聚糖及其衍生物时，需要综合考虑各种影响因素。3.3.1 分子量对壳聚糖抑菌活性的影响分子量是影响
14、壳聚糖抑菌活性的一个很重要的因素。对于真菌和细菌，一般来说随着壳聚糖的分子量或聚合度的增加，抑菌活性也相应提高，聚合度在 4 以下的几乎没有抑菌活性，一些聚合度较低的壳寡糖甚至会促进菌的生长。总体来看壳聚糖的抑菌活性要好于壳寡糖，分子量在 530 万之间的壳聚糖的抑菌效果相对较好。当然，壳聚糖的抑菌活性还受到脱乙酰度、pH、测试方法、测试菌株等多方面因素影响，还需要继续深入研究分子量对抑菌活性的影响。 3.3.2 浓度对壳聚糖抑菌活性的影响一般情况下，壳聚糖的抑菌活性会随浓度的增大而增强。El Ghaouth 等人 42 报道壳聚糖在 0.756.0 mg/mL 浓度范围，对Alternari
15、a alternata、Botrytis cinereaColletrotichum gloeosporioid 和Rhizopus stolonifer 的抑菌活性随浓度的增加而提高。Cheah 等人在用 1%4%的壳聚糖处理 Sclerotinia sclerotiorum 时也得到了相同的结论。在一定含量范围内，随着壳聚糖浓度的增加，抑制作用增强，且 0.4%壳聚糖对 6 种植物枯萎病菌的菌丝生长、产孢量以及孢子萌发的抑制作用均达到最大；但是随着壳聚糖含量的继续增加，其抑制作用反而下降，这可能与高含量时壳聚糖分子之间通过氢键自相聚集造成有效含量的下降有关。 3.3.3 pH 和溶剂对壳聚
16、糖抑菌活性的影响 pH 值大小决定着壳聚糖氨基质子化程度，同时也影响着壳聚糖的溶解性，此外，用不同的溶剂溶解壳聚糖，相同 pH 下，抑菌活性也会不同。严钦等人研究认为，壳聚糖因为具有质子化铵，质子化铵能与病菌带负电荷的细胞膜作用。干扰细菌细胞膜功能造成病菌体内细胞质流失，扰乱细胞的正常生理代谢，从而达到杀菌的目的。而在 pH 为中性时，壳聚糖中的氨基没有被质子化。因而不能抑制病菌的生长，反而是作为一种糖被病菌利用。由此可见，通常在微酸条件下，壳聚糖具有明显的抑菌效果，但是当 pH 值为 7 时，壳聚糖不但没有抑菌效果，反而还有一定的促进细菌生长的作用。钟秋平等 43 以芒果炭疽病菌、蒂腐病菌为
17、实验菌株，研究了不同 pH、酸溶剂的种类对壳聚糖抗菌活性影响。结果表明：在 pH4.8 和 pH6.0 时，壳聚糖的抑菌能力较强；壳聚糖的乳酸溶液对芒果蒂腐病菌有很强的抑制作用。 3.3.4 化学修饰对壳聚糖抑菌活性的影响近年来，随着对壳聚糖研究的不断深入，众多的壳聚糖衍生物不断涌现，其中壳聚糖季铵盐、羧甲基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、壳聚糖磺化衍生物、壳聚糖金属配合物 等衍生物等都被证明对细菌的生长有很好的杀死或抑制活性。3.3.5 晶体形状对壳聚糖抑菌性能的影响壳聚糖有 、 和 3 种晶型。目前，人们对壳聚糖的研究绝大多数是针对 晶型,对其它两种研究甚少。蒋霞云等通过对比 -壳聚糖
18、和 -壳聚糖的抑菌性能得出，具有高粘度和高脱乙酰度的 -壳聚糖的抑菌性能强于 -壳聚糖，从而，填补了壳聚糖抑菌性能研究在该方面的空白。4 展望壳聚糖无毒、无抗原性、可生物降解,并具有很多独特的生理功能，特别是壳聚糖对包括细菌、真菌在内的一系列微生物都有抑制作用,被视为开发新型天然食品防腐剂的理想材料。目前,壳聚糖直接作为防腐剂在食品中应用仍存在一些问题:壳聚糖本身的防腐抗菌效果存在缺陷,对细菌的抑制效果好,对真菌抑制效果差,最小抑菌浓度较高,低剂量使用无法起到防腐抗菌的作用,而高剂量使用又会影响食品的风味和质构。壳聚糖只能在酸性水溶液中溶解,无法满足在成分更为复杂的食品体系中。使用通过用化学修
19、饰的方法对壳聚糖分子进行改性,合成一系列新型的壳聚糖衍生物。旨在提高壳聚糖的抑菌活性,拓宽壳聚糖的抑菌谱,改善壳聚糖的溶解性,进一步分析明确壳聚糖基防腐剂分子结构与抑菌效果之间的关系。为新型型壳聚糖衍生物的抑菌的应用具有广阔的前景。参考文献：1 enel S, McClure S J. Potential applications of chitosan inveterinary medicine. Advanced Drug Delivery ReviewsJ, 2004, 56(10): 1467-1480. 2 Singla A K, Chawla M. Chitosan: some p
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