1、第五章 核 酸 化 学,目 录,核酸概述-第12章 核酸的结构-第13章 核酸的性质-第14、15章,5.1 核酸概述,核酸是生物大分子之一，在生命活动中起着重要的决定性作用。糖、脂是由酶（蛋白质）催化合成的，它们与蛋白质组合成复合体增加了蛋白质的功能多样性。蛋白质是生命体功能的体现着。而蛋白质的合成取决于核酸，核酸是决定生命体差异的根源。,5.1.1 核酸的发现与研究简史,1868年瑞士青年科学家F.Miescher从外科手术绷带上的脓细胞中分离出一种富含P的酸性化合物，称它为核素（nuclein），实际上就是我们现在所指的核蛋白。米歇尔因此被认为是细胞核化学的创始人和DNA的发现者。,研究
2、简史：,1868年1950年，研究核酸是什么 1953年4月25日，J.D.Watson和F.Crick提出DNA双螺旋结构 模型。 1958年Crick提出了“中心法则”，即遗传信息从DNA传到RNA，再传到蛋白质，一旦传给蛋白质就不再转移。 1970年代，诞生DNA重组技术（重组、克隆、测序） 1981年T.Cech证明RNA也具有催化功能（发现核酶） 1997年，第一次举行国际“蛋白质组学”会议 2003年4月14日，美、英、法、日、德、中完成人类基因组计划。,5.1.2 核酸的种类和分布P473,核酸分为两大类：脱氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid （DNA）核糖核
3、酸 Ribonucleic Acid（RNA）,DNA主要存在于细胞核中染色体上。,线型双链DNA,RNA主要存在于细胞质中,参与蛋白质合成的RNAtRNA（转移RNA） rRNA（核糖体RNA） mRNA（信使RNA）,其他：小RNA（小于300个核苷酸）核内小RNA（snRNA）、核仁小RNA（snoRNA） 核内不均一RNA（hnRNA）等。,病毒RNA,5.1.3 核酸的生物功能P475,DNA是遗传信息的载体证明实验：肺炎球菌转化作用,1944年，O.T.Avery（美）重做1928年Griffith的细菌转化实验，首次证明DNA是细菌遗传性状的转化因子。,前4个实验设计与Griff
4、ith相同 在上述实验的基础上，将从S型球菌中提取的 核酸、蛋白质及多糖分别注射R型小鼠，证明 了核酸的遗传转化功能。,RNA除主要参与蛋白质的生物合成外，还有基因表达的调节功能。证明实验：生长旺盛的细胞中（蛋白质合成旺盛），RNA含量特别丰富。,5.2 核酸的结构P478,5.2.1 核酸的元素组成,元素组成： C H O N P,核酸的元素组成有两个特点：1. 一般不含S。2. P含量较多，并且恒定（9%-10%）。 因此，实验室中用定磷法进行核酸的定量分析。（DNA9.9% 、RNA9.5%）,核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生
5、核苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴定。,核酸,核苷酸,核苷,磷酸,碱基,戊糖,核蛋白,蛋白质,基本结构单元：核苷酸（磷酸+戊糖+碱基）,5.2.2 核苷酸,5.2.2.1 戊糖,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。,1,3,2,4,5,1,3,2,4,5,5.2.2.2 碱基,碱基的种类和结构核酸中碱基有两类：嘌呤碱嘧啶碱它们是含氮的杂环化合物，具有弱碱性,1.嘌呤（Purine）碱,6,2,6,6-氨基嘌呤,2-氨基-6-氧嘌呤
6、,2. 嘧啶（Pyrimidine）碱,U,C,T,2，4-二氧嘧啶,5-甲基-2，4-二氧嘧啶,2-氧-4-氨基嘧啶,核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述五种常见碱基的甲基化产物。参见P479表13-2,5.2.2.3 磷酸（H3PO4）,核苷：戊糖 + 碱基 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键,5.2.2.4 核苷（nucleoside）,Adenosine Guanosine Cytidine Uridine,H,H,H,脱氧,脱氧,脱氧,修饰核苷（稀有核苷）,次黄苷（肌苷）I 黄嘌呤核苷 X,核苷中的戊糖羟基被磷酸酯化，就形成核苷酸。 核糖有3个自由
7、羟基，可分别被酯化生成2-，3-和5-核糖核苷酸。 脱氧核糖有2个自由羟基，可生成3-，5-脱氧核糖核苷酸。,核苷酸：核苷+磷酸 戊糖+碱基+磷酸,5.2.2.5 核苷酸（nucleotide）,自然界存在的自由核苷酸主要是5磷酸酯,5,5,含核苷酸的生物活性物质： NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD 等都含有 AMP,多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTP,环化核苷酸: cAMP，cGMP,5.2.2.6 核苷酸的衍生物,AMP,cAMP,（1）参与DNA、RNA的合成、蛋白质的合成、糖与磷脂的合成。(5-NTP和5-dNTP 分别为RNA, DNA合成的前体。 UTP, CTP, G
8、TP分别参与糖原、磷脂和蛋白质的合成) （2）在能量转化中起重要作用，ATP是生物体内能量的通用货币。 （3）是构成多种辅酶的成分：NAD、NADP、FAD、FMN和CoA。 （4）参与细胞中的代谢与调节，作为细胞之间传递信息的信使。 （cAMP、cGMP）。,核苷酸的生物学作用,多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C3-OH与另一分子核苷酸的5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。,5.2.3 核酸（多聚核苷酸）,5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羟基端（常用3-OH表示）。多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是35。,多聚核苷酸的表示方式（线条式
9、、文字式）,DNA RNA,5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGU,两大核酸的比较,5.2.4 核酸的结构,一、DNA的一级结构,5.2.4.1 核酸的共价结构,由四种脱氧核苷酸dAMP ， dGMP， dCMP，dTMP 通过3，5-磷酸二酯键连接起来的多聚核苷酸链。,脱氧核糖核酸的排列顺序 可以用碱基排列顺序表示 ATCCGTGCCA,连接键：3，5-磷酸二酯键 磷酸与戊糖顺序相连形成主链骨架 碱基形成侧链 多核苷酸链均有5-末端和3-末端,DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形
10、式。生物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。,1961年，F.Jacob和J.Monod提出了操纵子学说。阐明了原核生物基因表达调控的机制。,原核生物,基因（gene）：一段有功能的DNA片段，生物细胞中DNA分子的最小功能单位（交换单位）。 外显子（exon）:真核细胞的基因在表达过程中能编码蛋白质的核苷酸序列。 内含子（intron）:在转录后的加工中，从最初的转录产物除去的内部的核苷酸序列。,真核生物,碱基组成 A、G、C、U （AU/GC） 稀有碱基较多，稳定性较差，易水解 多为单链结构，少数局部形成螺旋 分子较小 分类 mRNA tRNA rRNA
11、其他RNA （hnRNA 核不均一RNA）（snRNA核内小RNA）,二、RNA的一级结构,5.2.4.2 核酸的高级结构（三维结构）,DNA的二级结构一，核酸化学结构和核苷酸键长与键角数据；二，Chargaff提出的碱基配对原则；三，DNA纤维的X射线衍射分析结果。,一、DNA的空间结构,1953年，J. Watson和F. Crick 在前人研究工作的基础上，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。,DNA的双螺旋模型,DNA双螺旋模型要点,1、DNA分子由两条反向平行互补的多核苷酸链构成双螺旋结构。两条链围绕同一个中心轴形成右手螺旋，螺旋表面有一条大
12、沟和一条小沟。2、嘌呤碱和嘧啶碱层叠于螺旋内侧，碱基平面与纵轴垂直，碱基间的堆集距离为0.34nm。磷酸和脱氧戊糖在外侧，靠酯键连接，形成DNA骨架，糖环平面与中轴平行。,3、双螺旋直径为2nm，顺轴方向每隔0.34nm有一个核苷酸，两个核苷酸之间的夹角为36，因此，沿中心轴每旋转一周有10个核苷酸。,4、两条链间的碱基以嘌呤碱对嘧啶碱，形成碱基对。配对原则是A=T，之间两个氢键，CG，之间三个氢键。因此两条链形成反向互补。,在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。,碱 基 对 间 的 氢 键,维持DNA双螺旋结构稳定的作用力：1）氢键2）碱基堆积力（疏水相互作用及范德华力）3）离
13、子键等DNA变性剂（脲/酰胺、有机溶剂）、热、pH、,B型结构W and C 提出的模型 在溶液中 A型结构碱基平面倾斜20，螺旋变粗变短，螺距23nm。 脱水时、DNA和RNA杂交时 Z型结构左手螺旋，锯齿状，细长而伸展，只有小沟,DNA双螺旋构象的多态性,双螺旋DNA的结构参数,噬菌体T2DNA长约50m,E-coli DNA 长约1mm,人类生殖细胞DNA长约1m,双链环状DNA（double stranded cyclic DNA, dscDNA）,双链环状DNA在自然界也是广泛存在的，如一些病毒DNA、一些噬菌体DNA、细菌质粒DNA、线粒体和叶绿体DNA等。,DNA的三级结构,大多
14、数DNA都是双链线状形式存在。例如：,1共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）的超螺旋结构（superhelical structure）,形成超螺旋的基础:,DNA双螺旋的扭曲 形成超螺旋（superhelix）,负超螺旋： 放松DNA双螺旋形成的超螺旋,正超螺旋： 旋紧DNA双螺旋形成的超螺旋,自然界中存在的超螺旋多数为负超螺旋结构，这有利于DNA的解链，在复制和转录中具有重要意义。,超螺旋DNA的性质,结构紧密，粘度较低，浮力密度大，沉降速度快。,2开环DNA（open circular DNA, ocDNA）,也称松环DNA（
15、relaxed circular DNA, rcDNA）,+,解链,3连环DNA（Catenanes DNA）,单体,二聚体,染色体(chromosome) 染色质(chromatin) 核小体(nucleosome),DNA 与 蛋 白 质 复 合 物 结 构,二、RNA的空间结构,1、转运RNA（transfer RNA, tRNA） 占RNA总量的15一种氨基酸对应最少一种tRNA,分子量25000左右，大约由7393个核苷酸组成，沉降系数为4S左右。 分子中含有较多的修饰成分。 3-末端都具有CpCpAOH的结构。,tRNA的二级结构,“三叶草”结构,（1）aa接受臂（amino ac
16、id arm）,（2）二氢尿嘧啶环 （dihydrouridine loop, DHU loop）,（3）反密码子环（anticodon loop）,（4）额外环（extra loop）,（5）TC环（TC loop）,tRNA的三级结构,倒 “L” 型,tRNA的三级结构与二级结构对应图,tRNA的生物学功能,tRNA的作用是多方面的，它接受氨基酸、携带氨基酸，把氨基酸转运到核糖体上，然后按照mRNA上的密码顺序装配成多肽或蛋白质。,tRNA必须识别相应的氨基酸和识别mRNA上相应的密码子。,tRNA怎样识别相应的氨基酸: 主要靠高度专一的氨 酰-tRNA合成酶。,tRNA怎样识别mRNA上
17、相应的密码子,密码子与反密码子配对,占RNA总量的80,2、核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA）,构成核糖体，组成蛋白质合成的场所。,原核生物以操纵子为转录单位，产生多顺反子mRNA，即一条mRNA上有多个编码区，可以翻译为多条多肽链。,3、信使RNA（messenger RNA, mRNA）,占细胞总RNA的35,真核细胞mRNA都是单顺反子，其一级结构通式为：3-末端有一段长达20-250个核苷酸的聚腺苷酸(polyA)，称为 “尾巴结构” ，5-末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为“帽子结构”。,5-cap的功能：,(1) 防止mRNA被核酸酶降解。,(2) 为mRNA翻译活
18、性所必需。,(3) 与蛋白质合成的正确起始有关。,3-polyA : polyA的残基数20250个，或更多。,polyA的功能 ：,(1) 保护mRNA，免受核酸外切酶的作用。,(2) 与翻译有关，没有polyA翻译活性降低。,(3) 与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。,mRNA与遗传密码,遗传密码（genetic code）,密码子（codon）,mRNA生物学功能,将细胞核内DNA上的遗传信息运送到核外，为蛋白质翻译提供模板。,遗传密码表,5.3 核酸的性质,5.3.1 一般的理化性质 线性大分子（粘度高）。微 溶于水，不溶于一般有机溶剂 两性解离 / 一般呈酸性（在中性溶液中带负电荷
19、） 可用电泳或离子交换（色谱）进行分离 室温条件下，DNA在碱中变性，但不水解，RNA水解 加热条件下，D核糖浓盐酸苔黑酚 绿色D2脱氧核糖酸二苯胺 蓝色 核酸分子高度不对称，因此旋光性较强，皆为右旋。,5.3.2 核酸的分离提取,核蛋白（DNP）,溶于水和浓盐溶液(1M,NaCl），不溶于生理盐溶液（0.14M,NaCl）。,DNA，RNA,苯酚，氯仿等蛋白质变性剂去除蛋白质等杂质。,反复用有机溶剂如乙醚、乙醇等沉淀，提高DNA纯度。,使用广谱蛋白酶去除核酸酶,异硫氰酸胍极强蛋白质变性剂去除RNase。,5.3.3 核酸的紫外吸收特性,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具
20、有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。 A吸光度，（P）消光系数,以A260/ A280进行定性、定量检测,A单核苷酸 A单链 A双链,5.3.4 核酸的变性、复性,5.3.4.1 变性 稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。核酸的一级结构(碱基顺序)保持不变。 变性表征生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应） 变性因素pH（11.3或5.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）加热,DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔点温度
21、，用Tm表示。 一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。 G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G, C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)2.44,5.3.4.2 热变性和Tm,5.3.4.3 核酸的复性,变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效应。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”。退火温度Tm25 PCR技术的原理复性影响因素片段
22、浓度/温度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）,5.3.5 分子杂交,DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。 Southern 杂交（Southern bolting） Northern 杂交（Northern bolting） Western 杂交 （Western bolting）,Southern印迹杂交（Southern blot）1975年由英国southern创建。 是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要
23、价值。Southern印迹杂交的基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和和高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着，附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置，从而可以确定在众多消化产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。,染色体（chromosome）,真核细胞的染色体,染色质：由DNA、组蛋白、非组蛋白和RNA组成染色体：由细丝状的染色质进一步折叠、盘绕、压缩而
24、成,染色质的基本结构单位核小体（nucleosome）,PCR技术的应用,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。,DNA在细胞中的复制是一个比较复杂的过程。参与复制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA模
25、板、由引发酶合成的RNA引物、核苷酸原料、无机离子、合适的pH、以及解开DNA的超螺旋及双螺旋等结构的若干酶与蛋白质因子等。 PCR是在试管中进行DNA复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加热(变性)、冷却(退火、保温(延伸)等改变温度的办法使DNA得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无限扩增。,PCR技术的基本步骤：,设计引物 优化反应体系，模板、原料、引物、酶等 选择3个温度进行热循环（25-30个循环）1）变性：94，45-60s2）退火： 60 ，1min3）延伸：72 ，1min 获得产物，检测扩
26、增结果,典型例题解析,1 DNA碱基配对主要靠 A 范德华力 B 氢键 C 疏水作用力 D 盐键 B,2 mRNA中存在，而DNA中没有的碱基是 A 腺嘌呤 B 胞嘧啶 C 鸟嘌呤 D 尿嘧啶 D,3 双链DNA之所以有较高的溶解温度是由于它含有较多的 A嘌呤 B 嘧啶 C A和T D C和G E A和C D,4 对Watson-Crick DNA模型的叙述正确的是 A DNA为双股螺旋结构 B DNA两条链的方向相反 C 在A与G之间形成氢键 D 碱基间形成共价键 E 磷酸戊糖骨架位于DNA螺旋内部 A,5 与片段TAGAp互补的片段为 A TAGAp B AGATp C ATCTp D T
27、CTAp C,6 在一个DNA分子中，若腺嘌呤所占摩尔比为32.8%，则鸟嘌呤的摩尔比为：A 67.2% B 32.8% C 17.2% D 65.6% E 16.4% C,7 下列关于核酸结构的叙述，哪一项是错误的？ A 在双螺旋中，碱基对形成一种近似平面的结构； B G和C之间是两个氢键相连而成； C 双螺旋中每10个碱基对可使螺旋上升一圈； D 双螺旋中大多数为右手螺旋，但也有左手螺旋； E 双螺旋中碱基的连接是非共价结合 B,8 DNA变性后，下列哪一项性质是正确的？ A 溶液粘度增大；B 是一个循序渐进的过程； C 形成三股链螺旋；D 260nm波长处光吸收增加； E 变性是不可逆的
28、。 D,1、如果有1014个细胞，每个体细胞的DNA量为6.4109个碱基对,试计算人体DNA的总长度是多少?这个长度与太阳地球之间的距离（2.2109公里）相比如何? 解：每个体细胞DNA分子总长为6.4X109X0.34nm=2.176X109 nm=2.176 m 人体内所有体细胞内DNA分子总长为2.1761014m=2.1761011Km 这个长度与太阳地球之间的距离相比为2.1761011/2.2X109 =99倍,2、在pH7.0，0.165mol/L NaCl条件下，测得某一DNA样品的Tm值为89.3。求出四种碱基百分组成。 解：因为（G+C）%=（Tm69.3）2.44=（89.369.3）2.44=48.8G+C=48.8% G = C = 24.4%而（A+T）%= 1 48.8% = 51.2% A = T = 25.6%,3、有一个DNA双螺旋分子，其分子量为3107Da，求：（1）分子的长度？（2）分子含有多少螺旋？（脱氧核苷酸残基对的平均分子量为618Da） 解：（1）分子的碱基对数为：3107/618 = 48544（对）分子的长度为：485440.34 nm = 16505nm = 1.650510-3cm（2）分子含有的螺旋数为：48544/10 = 4854（圈）,
