1、高效液相方法开发过程中色谱柱及流动相的选择1朱旭东电话：13920578450Email：xudong_2011年6月北京 / 400-606-8099 / 内容关于博纳艾杰尔液相色谱柱及流动相的选择 / 400-606-8099 / 博纳艾杰尔核心业务分离材料分离材料SPE柱柱FLASH柱柱GPCHPLC分析柱制备柱糖、多肽、核酸、蛋白凝胶色谱柱Bio SeparationChiral手性分离材料手性分离材料的规模化应用的规模化应用SPE工作站FLASH仪器仪器服务SPE设备设备从克到公斤级的纯化解决方案样品前处理 / 400-606-8099 / HPLC色谱柱及设备 / 400-606-
2、8099 / 拥有的品牌 Venusil 液相色谱柱 Promosil-液相色谱柱 Durashell-液相色谱柱 Optomix-液相色谱柱 Cleanert-固相萃取柱 CHEETAH-中压制备色谱 / 400-606-8099 / 内容关于博纳艾杰尔液相色谱柱的选择 / 400-606-8099 / 影响C18色谱柱性能的主要因素色谱柱与色谱填料的特性1、柱填料硅胶纯度粒径比表面积孔径2、色谱柱的构型色谱柱直径色谱柱长度3、固定相键合类型残余硅羟基的影响反相键合相的保留行为键合硅胶的稳定性物理因素化学因素色谱柱与色谱填料的特性 / 400-606-8099 / 如何选择合适的色谱柱？固定
3、相（填料）粒径孔径比表面积含碳量封尾高纯硅胶XBP-C18 5 100 380 22 Yes YesMP-C18 5 100 380 18 Yes yesASB-C18 5 150 200 10 no YesACE C18 5 100 300 15.5 yes yes ACE C18-300 5 300 100 9.0 yes yesbondapak C18 10 125 330 10 yes noCapcell Pak AG C18 5 120 300 15 yes no Capcell Pak UG C18 5 120 300 15 yes yes Cosmosil C18-AR 5 12
4、0 300 17 yes yes Develosil ODS-HG 5 140 300 18 yes yes Develosil ODS-MG 5 100 450 15 yes yes Develosil ODS-UG 5 140 300 18 yes yes Exsil ODS 5 100 200 11 yes no Exsil ODS1 5 100 200 11 yes no Exsil ODSB 5 100 200 12 yes no Genesis C18 4 120 300 ? yes yes Hichrom RPB 5 110 340 14 yes yes Hypersil BDS
5、 C18 5 130 170 11 yes no Hypersil GOLD 5 180 200 10 yes yesHypersil Hypurity C18 5 180 200 13 yes yes Hypersil ODS 5 120 170 10 yes no Inertsil ODS 5 100 350 14 yes no Inertsil ODS3 5 100 450 15 yes yes Inertsil ODS2 5 150 320 18.5 yes yes Kromasil C18 5 100 340 19 yes yes 部分商品化C18色谱柱填料参数比较 / 400-60
6、6-8099 / 柱填料对色谱柱性能的影响 / 400-606-8099 / 硅胶纯度I2.3-二羟基萘OHOHOHOH2.7-二羟基萘min0 1 2 3 4 5 6 7mAU 010203040VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF07091702.D)3.0084.084min0 1 2 3 4 5 6mAU 01020304050VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF07090605.D)Area: 253.288 2.275Area: 400.3992.889min0 1 2 3 4 5 6 7mAU 0510152025303540VWD
7、1 A, Wavelength=230 nm (LPF07091208.D)2.4503.471min0 2 4 6 8 10mAU 510152025VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF07091202.D)3.944Area:176.6865.934TF=1.31Brand W, AQ Column 5m, 4.6mm150mmVenusil MP C18 5m, 4.6mm150mm Brand H, C18 Column 5m, 4.6mm150mm Brand Z,C18 Column 5m, 4.6mm150mmmin0 1 2 3 4 5 6 7 8 9m
8、AU 010203040VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF07091711.D)2.899Brand U,C18 Column 5m, 4.6mm150mm！TF=1.42 TF=1.39TF=1.69TF=？流动相：甲醇：水=65：35流速：1 mL/min温度：35检测波长：230 nm 进样量：20L硅胶纯度金属含量 / 400-606-8099 / 硅胶纯度II硅胶纯度金属含量 / 400-606-8099 / 硅胶纯度III博纳艾杰尔科技提供色谱柱产品:硅胶均为高纯B型硅胶，硅胶金属含量 / 400-606-8099 / 粒径I13目前市场主要可供选择的填料
9、粒径 1.7m，1.8m，2.2m快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪 2.7m多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo) 3.0m，3.5m普通快速分析 5.0m常规分析颗粒越小，柱效越高, 但是耐污染性能下降，柱压升高. / 400-606-8099 / 粒径II硅胶粒径和类型对柱效的影响 / 400-606-8099 / 粒径III硅胶粒径和类型对压力的影响 / 400-606-8099 / 粒径博纳艾杰尔科技提供全面的粒径选择 2m，2.7m，3m，5m，10m分析色谱柱 5m，10m半制备和制备型色谱柱 / 400-606-8099 / 比表面积Iz每克填料的表面积（通常100
10、-400m2/g），与粒度，孔径有关z比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间增加(梯度洗脱尤为注意)z根据需要选择合适的比表面积 / 400-606-8099 / 比表面积II比表面积对平衡时间的影响时间B%0 53.0 253.1 54.0 5时间B%0 53.0 253.1 53.5 5色谱柱：2.130mm，3m1：Venusil XBP C18，380m2/g2：Venusil XBP C18 L，200m2/g增加0.5平衡时间 / 400-606-8099 / 孔径Iz多孔材料的95%以上表面在孔内部z样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部z孔径至少是样品流体学直径的4倍z
11、 300孔径用于：超过50个氨基酸的肽或25个残基的低聚寡核苷酸样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部 / 400-606-8099 / 孔径II小生物分子的保留值在小孔径填料通常更大色谱柱：C8 4.6150mm 3.5mA溶剂：0.1%TFA水溶液B溶剂：0.1%TFA于80%乙腈水中梯度：10% 30%B 20min 温度：60 流速：1.5mL/ / 400-606-8099 / 色谱柱的构型对色谱柱性能的影响 / 400-606-8099 / 长度和直径色谱柱尺寸对色谱分离的影响：短柱(15-100mm) -运行时间短, 柱压低长柱(150-250mm) -分辨率高, 运行时间长
12、窄径柱( 2.1mm) -检测器灵敏度高宽径柱(3-21.2mm) -载样量高 / 400-606-8099 / 固定相对色谱柱性能的影响 / 400-606-8099 / 键合类型A纵向交联：保留和选择不稳定B横向交联：宽pH适用，Durashell，Zorbax ExtendC单体键合：重现性好，柱效高D单体（空间保护）：低pH稳定（Zorbax SB，Venusil ASB） / 400-606-8099 / 残余硅羟基的影响I残余硅羟基的影响（二次保留效应）普通硅胶当流动相的pH 值大于4.5-5.0 时，表面的硅羟基会带负电荷，碱性化合物拖尾。-Si-O-+ R3NH+-Si-OH
13、+ R3N-Si-O-+HNR3-Si-O-+HNR3（TEMED）TEAMinutes30 60 90 120150N, N,N, N, -四甲基乙二胺180建立了与残留硅醇基的竞争强相互作用导致拖尾！阻断剂作用不够强 / 400-606-8099 / 残余硅羟基的影响II博纳艾杰尔解决方案封尾双层表面修饰 / 400-606-8099 / 残余硅羟基的影响III封尾键合填料与小硅烷进行后续反应，如三甲基氯硅烷，反应掉部分残余硅羟基，以增加表面覆盖率。缺点：不能完全反应（仍有50%的硅羟基未被反应）在pH3时，TMS易流失，耐用性，稳定性不好TMS / 400-606-8099 / 残余硅羟
14、基的影响IV不同长度和体积的键合相对表面覆盖率的影响无论使用何种键合相，至少有 50%的残余硅羟基！ / 400-606-8099 / 残余硅羟基的影响VSiOSiOSiOSiO Si O Si O HO OOOOO O HO OSi O SiSi O SiO OOOHHO O OSi SiO O O HSiSi SiSiOOO OCH3CH3CH3CH3SiOSiOSiOSiO Si O Si OO OOOOSi O Si OO OSi O SiSi O SiO OOOO O OSi SiO O OSiHHSiOOOCH3CH3CH3SiOOOCH3CH3CH3SiOOOCH3CH3CH3S
15、iOSiOSiOSiO Si O Si OO OOOOO Si OO OSi O SiSi O SiO OOOO O OSi SiO O OSiHHSiSiOHOHOHSiOHOHOHSiOHOHOHSiOSiOSiOSiO Si O Si OO OOOOO OO OSi O SiSi O SiO OOOO O OSi SiO O OSiHHSi SiSiOHOHSiOHOHSiOHOHR-Si(CH3)2-X(CH3)2Si-R(CH3)2Si-R(CH3)2Si-RHydrolysis双层表面修饰降低表面硅羟基活性，硅胶表面更加均匀 / 400-606-8099 / 硅胶双层表面处理技术原
16、理SiOSiOSiOSiO Si O Si O HO OOOOO O HO OSi O SiSi O SiO OOOHHO O OSi SiO O O HSiSi SiSiOOO OCH3CH3CH3CH3SiOSiOSiOSiO Si O Si OO OOOOSi O Si OO OSi O SiSi O SiO OOOO O OSi SiO O OSiSiOOOCH3CH3CH3SiOOOCH3CH3CH3SiOOOCH3CH3CH3SiOSiOSiOSiO Si O Si OO OOOOSi O Si OO OSi O SiSi O SiO OOOO O OSi SiO O OSiSiOOOCH3CH3CH3SiOOOCH3CH3CH3OHOHOHOHOHOHR-Si(CH3)2-X键合HHHHSiOSiOSiOSiO Si O Si OO OOOOSi O Si OO OSi O SiSi O SiO OOOO O OSi SiO O OSiSiOOOCH3CH3CH3SiOOOCH3CH3CH3OHOHOHOHOHOHHH(CH3)2Si-R(CH3)2Si-RSiOOOCH3CH3CH3OHOHOH(CH3)2Si-RSiOOOCH3CH3CH3OHOHOH水解 / 400-606-8099 /
