昆虫细胞培养手册.pdf

1、 TECON TECHNOLOGY CENTER NOVA LIU 昆虫细胞系的生长和维持 细胞系 简介： 本手册包括Sf9、Sf21和H5昆虫细胞以及提供 相关昆虫细胞生长和维持的一般信息。Sf9、Sf21和H5细胞系适于用杆状病毒或其他昆虫表达系统表达重组蛋白。 运输与储存： 运输：置于干冰上。 储存和传代：置于液氮储存。收到细胞即可开始，详见14页。 细胞系比较： 下面的表格总结了Invitrogen细胞系一般特征。订购信息见下页。 细胞 倍增时间 细胞外观 初始培养基 Sf9 72h 规则的带有颗粒球形。贴壁紧。 TNM-FH Sf21 24h 不同大小带有颗粒球形。贴壁紧。 TNM-

2、FH H5 18h 不同大小带有颗粒球形。贴壁松。 Express Five SFM 重要事项： Invitrogen（生命技术部分）通过RT-PCR证实H5细胞藏匿有内生的野田病毒。在一定条件下，H5产生野田病毒粒子。如此产生的病毒粒子未表现出对内原蛋白表达的不利的影响，或着在限制使用证书66号下已延伸和提供对H5细胞其它研究应用（见35页）。更多信息请联系技术支持。 用途： 仅供研究使用。禁止用于动物或人的疾病治疗和诊断。 Sf9和Sf21细胞系： 来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。此细胞

3、 系适用于InsectSelect系统。这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。 特征：Sf9和Sf21有下列共同特征：易于形成单层和悬浮培养、适用无血清培养基。 大小不同： Sf9细胞系克隆分离于IPLBSF21-AE(Sf21)。体积较小大小规则的使其易于形成单层和铺培养板。Sf21在大小和形成单层以及铺板规则上有一些不同。 用途： 两者都适于转染、纯化、生产高滴度病毒、铺板以及表达重组蛋白。如果你是第一次使用杆状病毒，你会发现Sf9细胞易于从斑块中分离。在一些结构上Sf21细胞可能比Sf9细胞表达蛋白量高。 H5细胞系： 来源： H5细胞系源于博

4、伊斯汤普森研究所对植物的研究，伊萨卡、纽约和源于白菜尺蠖卵巢细胞，粉纹夜蛾。 特性：此细胞系有如下特性: -1 -TECON TECHNOLOGY CENTER NOVA LIU 倍增时间小于24h； 适于贴壁培养，但易形成不整齐的单层，导致空斑鉴别困难； 适于悬浮培养和无血清培养； 提供5-10个折叠（针对选择的蛋白）分泌表达量比Sf9 细胞高。 用途：H5 细胞表达重组病毒性能优越。也经常用于转染和空斑纯化；然而，如果重组体不是蓝色分离重组的空斑就比较困难。 昆虫表达系统： 大量从Invitrogen获得的表达系统在Sf9、Sf21或H5昆虫细胞中能便利的表达重组蛋白。Bac-to-Bac

5、杆状病毒表达系统适于用杆状病毒来表达重组蛋白，同时InsectSelect适于用无细胞溶解素的系统来表达蛋白。更多关于表达系统的信息请访问或致电技术服务。 哪个细胞系最好用? 推荐Sf9或Sf21细胞用于转染、纯化和增殖重组病毒。 Sf9细胞大小一致， 易于操作，能形成良好的单层细胞用于空斑实验。Sf9和Sf21细胞也能用于重组蛋白的表达，但是H5细胞系的生产量更高。 推荐用H5细胞系来表达分泌型重组蛋白。其能在无血清培养基中培养，适应悬浮培养以及能生产大量的重组蛋白。 注意： 一般来说易于用一种细胞系来表达蛋白达到最优化的程序。一旦确定用一种细胞来表达重组蛋白，其它细胞系可以尝试优化表达水平

6、。 注意: 当设计纯化多聚组氨酸标签蛋白的计划时，注意无血清培养基不能直接用于螯合树脂，因为培养基的成分会除去树脂中的镍离子。 订购信息：见下表从Invitrogen获得冻存细胞信息 细胞 冻存 Sf9 货号：B825-01 1107细胞/ml 60Graces培养基，30胎牛血清，10DMSO Sf21 货号：B821-01 1107细胞/ml 60Graces培养基，30胎牛血清，10DMSO H5 货号：B855-02 3106细胞/ml 添加90mL/L谷氨酰胺的Express Five SFM需要92.5 7.5DMSO 培养基 昆虫细胞培养基： Sf9，Sf21和H5能在含血清或无

7、血清培养基 中生长（更多信息见12页培养基注意事项）。推荐如下培养基用于每个细胞系（见下表）。 -2 -TECON TECHNOLOGY CENTER NOVA LIU 细胞 含血清培养基 无血清培养基 Sf9 Graces昆虫培养基 Sf-900SFM Sf21 Graces昆虫培养基 Sf-900SFM H5 Graces昆虫培养基 Express Five SFM 培养基订购信息： 从Invitrogen获得的GIBCO昆虫培养基用于培养Sf9，Sf21和H5昆虫细胞。订购信息见下表。 产品 数量 货号 非悬浮Graces昆虫培养基 500mL 11595-030 悬浮Graces昆虫培

8、养基 500mL 11605-094 500mL 10902-096 Sf-900SFM 1L 10902-088 Express Five SFM 1L 10486-025 方法 细胞操作技术 无菌技术： 需在层流罩无菌条件下进行昆虫细胞培养。 传代培养： 传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。 贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。 例如：T75方瓶装12mL培养基长成单层。将细胞吹下来，取2mL移入新的装有8mL培养基的T75方瓶，这就是1:5稀释（最终10mL体积中含2mL细胞）。 悬浮培养：在细胞密度达

9、到2.0106-2.5106细胞/mL后将密度调整至0.7106-1.0106细胞/mL进行悬浮传代。 例如：在装有50mL细胞培养基的100mL摇瓶中细胞密度达到2.0106细胞/mL。移取25mL含细胞的培养基再加入25mL新完全培养基使细胞终浓度达到1.0106细胞/mL。 融合： 融合是细胞进行传代培养的标志。 定义： 贴壁细胞汇集成单层布满整个获得的生长表面。在形成第一层或开始从壁面悬起后，一旦细胞形成团簇，就要开始进行传代。 传代融合细胞： 细胞在旧的融合表现倍增时间较少或活率降低以及减少贴壁时应立即传代。细胞培养以及认为不太健康了。 融合前传代： 未形成融合前的细胞不易移除，需较

10、大的机械力。在未融合前传代，细胞表现倍增时间较短或活率降低（更多信息参见30页疑难解答）。细胞培养以及认为不太健康了。 漂浮物： -3 -TECON TECHNOLOGY CENTER NOVA LIU 漂浮物常发生且常见于旧培养基和过度生长培养基中。 定义：细胞无论是松散贴壁或悬浮于培养基中。 注意：如果漂浮物超过5，在传代之前用新鲜的培养基取代含漂浮物的培养基。 存活的漂浮物： 许多漂浮物仍然存活。检查活率，移取一小份含漂浮物的培养基用于台盼蓝染色实验。假如漂浮物的活率较高（95），细胞可用于增殖，将含漂浮物的培养基移至装有新鲜培养基大小合适的瓶子中。 脱落： 非常柔和的培养方法可使细胞活

11、率高。特别用这种方法移除贴壁培养的细胞。 定义：通过培养基吹打从壁面移除细胞。此技术程序见贴壁培养17页。 倍增时间： 昆虫数量倍增时间不同，依赖于生长条件。 健康细胞倍增时间： Sf9细胞倍增时间72h； Sf21细胞倍增时间24h； H5细胞倍增时间18-24h。 注意： 如果倍增时间超过24-72h，则初始细胞浓度、活率、培养基、温度或氧化作用可能出现问题。更多有关倍增时间超过24h的信息见30页疑难解答。 活率： 为了维持最佳贴壁和悬浮状态，应通过细胞计数有规律的进行评价细胞活率。 定义：细胞活率是指在培养基中活细胞所占的比例。细胞活率是通过台盼蓝染色测定。台盼蓝染料不能通过活细胞膜，

12、但能很快进入死细胞。变蓝的细胞就是死细胞。 最低要求： 健康对数生长期细胞活率至少应不低于90。活率低于90细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验。如果你的细胞有活率低于90的问题见第30页疑难解答。 细胞记录： 细胞记录对于监控昆虫细胞密度和活率非常重要。做好细胞记录能使你记住需要进行细胞培养的日期。并且细胞记录有助于疑难问题的解决（见第30页）。 定义：细胞记录或细胞笔记应包括如下内容： 最初培养日期； 原始发货批号； 传代日期； 每次传代的代次； 传代的密度； 传代的活率； 冻存代次； 任何细胞出现的情况； 培养基及其批号。 生长温度： 干燥的环境中维持细胞生长需27。新鲜培养基在使用前需

13、升至室温。室温细胞维-4 -TECON TECHNOLOGY CENTER NOVA LIU 持生长置于工作台上或抽屉里，但建议环境温度控制在27。 低于27： 低于27昆虫细胞生长缓慢。当温度恢复到27，细胞能恢复到正常倍增时间。 高于27： 27-30之间，昆虫细胞倍增时间加长。高于30细胞活率降低。细胞长时间暴露在30以上高温则不能再用。如果温度恢复到27细胞也不能恢复原来的状态。 CO2： 昆虫细胞培养不需要CO2。 浓缩细胞： 如果细胞密度太低（5105细胞/mL）细胞需浓缩以达到对数生长。 浓缩细胞至较高密度（1106细胞/mL）将出现对数生长状态（见第27页）。 细胞分散： 在转

14、染和空斑试验之前，细胞需均匀的分散至组织培养板表面。 目的：这将确保如下： a) 细胞分散不均，导致形成不匀称的单层； b) 最大表面积用来感染。 步骤： 分散细胞，用手从前往后一边到另一边慢慢轻摇细胞瓶或板子。重复四次，仔细观察确保液体布满所有生长表面。不要用圆周运动来分散细胞，这样会引起细胞聚集板子边缘而不均匀分布。 重要事项： 所有添加或移除培养基操作需在层流罩下进行，且在无菌条件下及使用无菌设备。 添加或移除培养基-方瓶： 从方瓶中移除含细胞的培养基时，倾斜瓶子使培养基流到瓶角，远离细胞单层。用移液管小心移除培养基。避免触碰细胞单层。 添加培养基时，轻柔的吸取培养基置于远离细胞单层的一

15、边。在细胞贴壁松散和部分脱落时轻柔的处理细胞。 添加或移除培养基-培养板： 从摇瓶中移除培养基，拧掉摇瓶臂上的螺丝帽。小心从瓶臂插入移液管不触及瓶壁吸除培养基。从摇瓶的瓶臂小心移出移液管，避免触碰瓶壁或掉液。每次更换移液管，每次插入摇瓶的移液管只能用一次。 给摇瓶添加培养基时，拧掉瓶臂上的螺丝帽。小心插入移液管不触碰瓶壁添加培养基。从摇瓶的瓶臂小心移动出液管，避免触碰瓶壁或掉液。每次更换移液管，每次插入摇瓶的移液管只能用一次。 培养基因素： 与杆状病毒作用： 与杆状病毒或野毒株作用时，细胞培养和病毒作用的培养基要分开。杆状病毒粒子能在4存活和维持，在传代过程中会通过给培养板或方瓶加液污染细胞。

16、 -5 -TECON TECHNOLOGY CENTER NOVA LIU Graces昆虫培养基/TNM-FH: Graces昆虫培养基: Graces昆虫培养基,非补充培养基单独从Invitrogen获得（货号11595-030）。 注意：此培养基含L-谷氨酰胺。 含补充添加物的Graces昆虫培养基：含补充添加物的Graces昆虫培养基单独从Invitrogen获得（货号11605 -094）。其补充添加TC酵母和乳清水解物。补充添加培养基与TNM-FM有关（粉纹夜蛾）。 完全TNM-FH培养基: 不添加10胎牛血清的TNM-FH不能认为是完全培养基。 血清提供营养以及在摇瓶中从流体压力

17、下保护细胞。 血清敏感性：在使用之前血清无需预热。但是血清质量对细胞最佳生长状态较重要。来自不同供应商或同一个供应商不同批次的血清质量变化较大且影响细胞生长最佳状态。在所有昆虫细胞培养前强烈推荐检测新批次等份试样血清。更多血清敏感信息见疑难解答第30页。 pH： TNM-FH和Graces昆虫培养基不含pH指示剂。对于Sf9在这种培养基中正常pH为6.2。和哺乳动物细胞培养不同，pH随细胞生长逐渐升高，但通常不会超过6.4。 稳定性：TNM-FH完全培养基在4可稳定放置一个月。 抗生素：许多抗生素适用于昆虫细胞。通常在存贮培养用10g/mL庆大霉素在培养基中。 下表总结了最常用抗生素工作浓度和

18、作用机理。 抗生素 工作浓度 使用方法 庆大霉素 10g/mL 阻止细菌蛋白合成 两性霉素B 0.25g/mL 固定甾醇干扰膜通透性 青霉素- 链霉素 100-200U/mL 100g/mL 阻止细胞壁合成、 阻止细菌蛋白合成 准备TNM-FH完全培养基： 如果要培养Sf9和Sf21细胞，准备TNM-FH完全培养基。如果可能用之前要准备好。不被污染，TNM-FH完全培养基可在4保存一个月。 1. Graces昆虫培养基500mL添加55mL胎牛血清和10mg/mL庆大霉素储存液500L，用移液管混匀； 2. 用0.2m滤器无菌条件下过滤； 3. TNM-FH完全培养基4保存； 4. 使用前升至

19、室温。 重要事项: Graces培养基不加补充添加物和血清则细胞不长。 无血清培养基： 推荐Sf9和Sf21细胞系使用Sf-900SFM培养基， H5细胞用Express FiveSFM培养基。 补充添加物：无血清培养基完全不需任何添加成分或加血清。然而添加2的血清会减小感染过程中蛋白水解量。 表面活性剂：许多无血清培养基含有表面活性剂，如PluronicF-68能减小悬浮培养-6 -TECON TECHNOLOGY CENTER NOVA LIU 中细胞膜的剪切力。 注意：无论Sf-900SFM还是Express Fiv eSFM培养基都含有表面活性剂。无需再添加。 适应性： 推荐细胞在含血

20、清培养基中生长适应无血清培养基比直接转换新的无血清培养基要简单。逐步适应过程（见27页）需确保细胞处于最佳生长状态。 优点：使用无血清培养基优点如下: 1)降低昂贵血清成本； 2）简化分泌重组蛋白纯化过程； 3）消除血清组织敏感性。 准备无血清培养基： 用无血清培养基按照手册指导。一般比起完全培养基来说，对于无血清培养基没有附加准备要求。 注意Express Five SFM培养基不含L-谷氨酰胺。用前500mL Express FiveSFM培养基添加200Mm L-谷氨酰胺（货号25030-081）45mL。推荐添加庆大霉素10g/mL。其它抗生素选择添加（见前页）。 冻存细胞初始培养 简

21、介： 以下内容将使你开始培养你选择的冻存细胞。来自Invitrogen（Sf9和Sf21）的冻存昆虫细胞代次少于15代。 实验大纲： 下表阐述冻存昆虫细胞初始培养所需步骤。 步骤 过程 1 从液氮或干冰中取出细胞（如果立即收到）。 2 在所需培养基中融化细胞。 3 吸附30-45min。 4 移除旧培养基（含DMSO）然后加新鲜培养基。 5 长满单层传代。 6 细胞倍增时间达到18-24h，活率达到95即可传代。 7 冻存几管低代次细胞备用。 融化H5细胞系： 推荐在Express Five SFM培养基中融化H5细胞较好。然而有许多不同配方的无血清昆虫培养基可选用。如果你有不同无血清培养 基

22、或希望H5细胞在TNM-FH完全培养基中培养，直接在新培养基中融化细胞。通常是安全的在换新培养基配方后直接在里面融化细胞。注意细胞适应新培养基前细胞活率降低且生长缓慢。另一种选择是在Express FiveSFM融化和培养H5细胞，然后细胞适应新培养基如前所述见27页。 初始培养冻存细胞： 融化好细胞不总呈现圆形；部分无固定形态或表现皱缩。这表明部分细胞溶解或形-7 -TECON TECHNOLOGY CENTER NOVA LIU 成漂浮物。连续两轮传代细胞碎片和漂浮物可去除。 冻存过程会损伤细胞， 经解冻导致20-25死亡。 例如， 1107细胞冻结， 7.5106-8106细胞复活。 1

23、. 从干冰或液氮（假如储存）中取出细胞冻存管置于37水浴中。轻柔搅动快速融化直到细胞都融化为止。从水浴中取出细胞。融化后细胞移出37否则导致细胞死亡； 2. 快速用70酒精消毒冻存管外表，晾干后置于冰上； 3. 预湿覆盖贴壁表面4mLTNM-FH完全培养基的25cm2细胞瓶； 4. 移取1mL细胞悬液至4mL培养基中； 5. 将培养瓶置于27培养箱贴壁30-45min； 6. 细胞贴壁后轻柔的去除培养基。 此步骤是为了细胞贴壁后尽快移除冻存液中的DMSO。此过程也能去除细胞碎片和未贴壁的不健康细胞； 7. 添加5mL新鲜培养基； 8. 24h后更换培养基。用这种方式复苏，细胞活率需高于70。继

24、续孵育直到细胞形成单层。此时应进行传代。继续进行贴壁细胞培养见17页。 如果细胞活率没超过70，将细胞置于27再过一夜。在另外24-48小时孵育后，如果大量细胞继续脱离，致电技术支持（见34页）。 注意： 冻存H5细胞需42.5新鲜Express Five培养基，42.5旧Express Five培养基，10DMSO和5胎牛血清。我们发现血清有助于细胞贴壁。在融化细胞贴附培养皿底部后（过程见前页），移除培养基并补充Express FiveSFM。 贴壁培养基VS悬浮培养基 贴壁培养基： 下表总结部分重要因素。 正 反 容易且廉价培养 需机械操作易造成活率较低。 在倒置显微镜下易于观察感染过程

25、需若干培养瓶（如；150cm2培养瓶）用于扩大表达及高滴度病毒储存。 所有细胞可用这种方法维持培养（Sf9、Sf21、H5） 单层限制每毫升细胞密度，影响蛋白产量 悬浮培养： 下表总结部分重要因素。 正 反 能产生从250mL到1L多高滴度储备液或表达的蛋白在每个摇瓶中。便于大规模蛋白表达。 需摇瓶、旋转板、孵育箱，启动昂贵。 需细胞密度高（Sf9需达到3.0106个细胞/mL）这样能增加每毫升细胞培养的蛋白产按照生长模式和感染过程需每天细胞计数和活率测定 -8 -TECON TECHNOLOGY CENTER NOVA LIU 量 大量充氧和少量操作可增加细胞活率，细胞活率通常达98或更高。

26、 难于维持无菌状态 Sf9和Sf21无需适应即可从贴壁转成悬浮培养反之亦然 H5细胞需适应悬浮培养 贴壁细胞培养 简介： 如下内容能使你成功培养贴壁细胞。你必须在建立悬浮培养前维持贴壁细胞系的培养。Invitrogen的冻存细胞（Sf9、Sf21和H5）需始于贴壁细胞培养，然后悬浮培养扩大规模。 维持贴壁培养： 每天观察细胞直至形成融合单层。一旦融合单层形成则可以进行传代培养。 小部分细胞开始从培养瓶底脱落后，细胞融合成单层或变得细长才开始进行传代。此时细胞易移除。在移除细胞过程中机械力使用越少，对细胞的活率越好。 不要使细胞过度生长：细胞稠密过了融合期反复传代导致倍增时间缩短和活率降低。 细

27、胞禁忌分瓶过多：密度低于20的融合抑制细胞生长。最健康的细胞是对数生长期的细胞。对数生长期的细胞可维持1：5稀释传代。 保持记录传代号：传30代或更多（培养2-3月会延长倍增时间至28-32h），细胞通常开始失去其活率和感染率。需重新复苏细胞开始培养。 坚持记细胞日志：记录培养细胞密度（融合）、活率、传代号和一般现象及冻存会有助于解决实验中产生的问题。见29页简单的细胞日志。 推荐培养体积： 下表总结培养瓶培养昆虫细胞推荐传代培养体积。 培养瓶大小（cm2） 体积（mL） 25 5-10 75 15-20 150 40-50 融合细胞密度： 通常获得融合培养Sf9、Sf21和H5细胞密度如下。

28、细胞数量依赖于培养条件和细胞健康状况（如上述维持健康培养的建议）。用如下数据作为一般指导在建立实验或建立从方瓶到悬浮培养（见20页悬浮培养）；但是在做实验前，必须计数实际细胞数量。 培养瓶（cm2） Sf9 Sf21 H5 25 4.01063.81063.010675 1.21071.11079.0106150 2.41072.31071.8107贴壁细胞培养方法: -9 -TECON TECHNOLOGY CENTER NOVA LIU 此方法能用于贴壁培养细胞的移除。 脱落（此方法乃Invitrogen方法）； 轻叩培养瓶至细胞松动； 刮离（此方法万不得已不得使用，因其损害导致活率降低）

29、。 脱落： 用脱落方法仅用于使最小人力和最小机械力移除单层细胞，比起其它方法细胞活率较高。脱落方法涉及用培养基吹打单层细胞步骤如下： 1. 从培养瓶中移除所有5mL培养基（与培养瓶大小无关）； 2. 倾斜培养瓶使剩余的培养基流至一角远离细胞； 3. 用无菌移液管吸起瓶底角的剩余培养基，吹打细胞。随着移动瓶子从瓶底至瓶口，吹打从一边到另一边。吹打用轻柔移除细胞。如下图。 4. 一旦细胞开始脱落，剩余的就比较容易移除。 注意： 如果发现H5细胞贴壁不好，加5血清。一旦细胞贴壁生长达到75-80融合，需用Express Five SFM替换含血清培养基。 悬浮培养 重要事项： 在建立悬浮培养前必须维

30、持培养贴壁细胞系。购自Invitrogen冻存细胞初始为贴壁培养。健康贴壁细胞能悬浮培养扩大规模。 维持悬浮培养： 观察和记录细胞生长： 细胞需每日观察通过细胞计数和检测活率。如果日志记录维持对数生长日期或图表，这样有助于做出正确培养健康细胞的决定。见29页简单细胞日志。 每月更新培养基： 悬浮培养细胞能保持一个月的对数生长期。此点表明，新的培养基需应始于细胞丧失感染力以及按程序使用不在最佳状态。 维持对数生长密度： 当Sf9、Sf21和H5细胞密度达到2.0106-2.5106个/mL时，需稀释至不低于7.0105个/mL。 使用合适的瓶子： 用装有垂直叶轮的转瓶比用组装的悬挂搅拌杆的要好。

31、垂直旋转叶轮能提供良好的通风。 维持体积保证通风：为了适度通风转瓶总培养基体积不能超过1/2转瓶子规定体积（如：500mL转瓶不能装超过250mL的培养基）。 表面活性剂可降低剪切力： 推荐0.1Pluronic F-68用于悬浮培养。Pluronic F-68表面活性剂降低由叶轮推力产生的细胞膜剪切力。 注意：Sf-900SFM和Expr ess Five SFM已含有表面活性剂。 当培养细胞悬起不必换培养基。 规律的传代要求移除悬浮细胞和添加足够的可使细胞密度调 整至1106个/mL的培养基。添加的培养基需满足细胞营养需求。 叶轮应旋转顺畅排除任何急动和跳动。 叶轮平滑转动是良好通风和高细

32、胞活率所必须- 10 -TECON TECHNOLOGY CENTER NOVA LIU 因素。 保持转瓶无菌状态： 为避免污染和保持健康，无菌悬浮培养： 孵育培养细胞时拧紧瓶盖。通风无需松盖，松盖是造成污染的潜在因素； 打开转瓶传代或移除培养基时用组织培养罩； 移液或加液时不能掉液或触碰转瓶臂； 禁用肥皂清洗转瓶，由于残留成分会引起细胞死亡。推荐用10乙酸或其它购得洗涤剂清洗转瓶。 确保所有转瓶垫圈绷紧以及转瓶上方预先高温消毒；水气是引起转瓶污染的原因。转瓶盖高温消毒时需拧松。 用于感染杆状病毒的转瓶需高温消毒至少两次（如：高滴度毒储存、蛋白表达）。一次高温消毒和一次高温干烤是确保无菌的最低

33、要求。杆状病毒粒子高温消毒后仍然活着能造成污染（见27页清洗转瓶步骤）。 Pluronic F-68： 推荐添加Pluronic F-68（货号24040-032）在转瓶培养基中，使终浓度达到0.1。Pluronic F-68能减小由叶轮旋转产生的细胞剪切力。部分无血清培养基已添加Pluronic F-68或其它合 适的表面活性剂。 注意：Sf-900SFM和Express Fi ve SFM已含有表面活性剂，无需添加。 开始转瓶培养的最低要求： 起初要想获得成功的转瓶培养，需满足如下最低要求： 细胞活率达到95或更高； 最低密度需达到1.0106个/mL； 叶轮需浸没1cm或更多确保通气。

34、不同转瓶最小体积总结如下： 转瓶大小（mL） 需要最小体积（mL） 100 30 250 80 500 200 注意：未推荐初始转瓶培养量超过500mL。建议先用小转瓶培养稳定后再扩大培养。 摇瓶悬浮培养： 相对于转瓶你也许希望昆虫细胞悬浮培养在摇瓶中。在摇瓶中用含血清或无血清悬浮培养程序理查德已描述过，1995，分别在第3-4章。 悬浮细胞培养：Sf9和Sf21细胞系 简介： 如下程序能使你将组织培养瓶中贴壁培养的Sf9和Sf21细胞转移至瓶培养。此程序容许开始或维持Sf9和Sf21细胞悬浮培养。 更多有关悬浮培养信息，见20页悬浮培养。 所需材料： - 11 -TECON TECHNOLO

35、GY CENTER NOVA LIU 贴壁昆虫细胞Sf9和Sf21； 转瓶（Bellco#1965系列）； 磁力搅拌板 27恒温培养箱不需CO2。 悬浮培养Sf9和Sf21细胞: 初始使用任何培养基，对数生长期细胞活率达到95或更高才能确保成功。Sf9和Sf21快速初始悬浮培养： 1. 需要足够密度达到1106个/mL对数生长期的贴壁细胞用于转瓶培养。初始密度低会引起初期倍增时间缩短。见17页融合细胞密度，有助于决定需要多少培养瓶细胞足够初始转瓶培养。 注意：推荐开始用100mL或250mL转瓶，初始培养需要少量细胞比起大培养瓶。 2移出细胞，计数以及确保活率至少达95； 3需足够细胞密度达到

36、1106个/mL置于干净无菌相应大小的转瓶中； 例如：100mL转瓶需50mL培养基细胞密度达到1106个/mL，总得所需活细胞数为5107个。 427恒温孵育转瓶，80-90转/min搅拌； 5当细胞密度达到大约2106-2.5106个/mL时，添加足够的培养基稀释使细胞密度调回到1106个/mL。这出现在24-72h内。检查细胞日志里的密度和活率。 维持悬浮培养Sf9和Sf21： 一旦达到转瓶容许的最大体积（容许最大体 积=1/2转瓶实际体积），需转移至更大的转瓶或维持你所需体积。 维持体积：细胞密度达到2106-2.5106个/mL时细胞进行传代。确保传代细胞密度不高于4106个/mL或

37、保持密度高于1106个/mL以达到对数生长状态。 增加转瓶大小：转移足够体积，密度达到2106个/mL的培养基置于大的转瓶密度调至不低于1106个/mL。保证最小体积要求（见前页最小要求）。添加足够新鲜培养基调整密度至1106个/mL。继续维持培养或重复此步骤增加转瓶大小直到达到需求的体积。 悬浮细胞培养：H5细胞系 简介： 如下程序，贴壁H5细胞从组织培养瓶转移至转瓶。无血清含肝素培养基用于减少细胞聚团。细胞经传几代直至活率高于95以及 倍增时间达到18-24h.此时细胞可断掉肝素。如果断掉肝素细胞继续生长不聚团，则细胞完全适应悬浮培养。 所需材料： H5昆虫细胞（Invitrogen）；

38、Express FiveSFM（Invitrogen）； 肝素，组织培养级（Sigma，货号H3149）； 转瓶（Bellco#1965系列）； 磁力搅拌板；27恒温培养箱，无需CO2。 - 12 -TECON TECHNOLOGY CENTER NOVA LIU 重要事项： H5生长时，不要使细胞密度超过2.5106个/mL，这样细胞会形成大的聚团。 如果细胞在初始培养活率低于60（见下页）， 则细胞不再健康也不适应这个过程需重新培养新H5细胞。 使用肝素： 肝素可使H5不形成聚团。在细胞分裂或培养基体积增加时，用每毫升补加10单位肝素的无血清培养基。 如在任何时候，悬浮培养基开始形成大的聚

39、团（10个细胞/团），加肝素10个单位每毫升培养基。在细胞计数板下观察有5-10 个细胞小的聚团，对于悬浮培养的H5属正常现象不影响表达。 最初生长阶段：、 最初阶段需3-4天。 1. 四瓶融合贴壁H5细胞，分离置于一个100mL的转瓶中。总体积需40-50mL细胞密度需达到0.7106-1.0106的H5细胞。用无血清培养基调整体积或细胞密度并加含10单位的肝素每毫升的培养基。总体积不能超过转瓶体积的50； 2. 转瓶27恒温孵育，搅拌速度80-90rpm，放置24h； 3. 24h后，细胞计数检测活率和细胞密度。细胞活率需达到90。如果细胞密度低于2.010个/mL，让继续生长； 4. 细

40、胞密度一旦达到2.0106或更高，传代并调整细胞密度至1106扩大至第二个100mL转瓶添加肝素。现在有两个100mL摇瓶，每瓶50mL培养基。假如传代前细胞生长时间超过24h（如超过周末），细胞密度可能达到0.8106个/mL。 5. 继续培养细胞每天检测细胞密度和活率。当细胞达到2106个/mL活率到达95，扩大至500mL摇瓶。 适应培养： 适应性定义为活率达98和500mL悬浮培养液每18-24h倍增一次。如下将细胞转移至500mL转瓶： 1. 汇集两个100mL转瓶内细胞至一个500mL转瓶，再加150mL含肝素的无血清培养基。确保细胞密度不低于0.8106个/mL； 2. 继续培养

41、然后按照上述第四步分摊细胞，直至在适宜的转瓶中活率达98每18-24h倍增一次，通常为500mL或1L； 3. 一旦细胞每18-24h倍增一次且活率达到98，需慢慢断掉肝素。当分摊细胞时，是最佳实现加无肝素培养基的时机。 细胞一经适应，不聚团则无需加肝素。 维持悬浮培养H5细胞： 一经达到给定转瓶容许最大培养体积（最大容许体积=1/2转瓶标明体积），则需升级至更大转瓶或维持需要体积。 维持量：当细胞密度达2.0106-2.5106个/mL时则传代细胞。在细胞密度不高于2.5106且保持不低于1106个/mL时，才能确保传代细胞呈现对数生长状态。 - 13 -TECON TECHNOLOGY C

42、ENTER NOVA LIU 增大转瓶大小：将细胞密度达到2.0106足够培养基转移至较大的转瓶密度调整至1.0106个/mL。保证维持最小要求体积（如上）。加足够的新鲜培养基调整细胞密度至1.0106个/mL。继续维持体积（如上）或重复增加摇瓶的过程直至达到想要的培养体积。 长期储存悬浮H5细胞： 适应悬浮培养的H5细胞可在冻存液(42.5旧培养基，42.5新鲜培养基， 10DMSO和5FBS)中进行冻存。 1. 需每管细胞密度达到3106个/mL。 这样需要2106个/mL细胞培养基15mL且细胞需要离心。用10mL冻存液重悬细胞后每毫升装一管； 2. 置于-8024h，然后移至液氮。 融

43、解适应悬浮H5细胞： 已适应悬浮培养且冻过的H5细胞在适应悬浮培养前首先需要贴壁培养。H5悬浮培养需要肝素和断掉肝素如上所述。然而，适应过程不能像H5细胞永远不能适应悬浮培养。 冻存程序 简介： 一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。细胞需达到 90活率和80-90融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。当融解细胞，它将会达到最佳使用状态。 程序： 用下表中冻存液冻存个细胞系。注意Graces Insect培养基不含补充成分或血清。 细胞系 冻存液 密度（个/mL） 解冻后附着时间（min） Sf9 60Graces Insect 培养基 30胎牛血清 10DMSO 110730-45 Sf2

44、1 60Graces Insect 培养基 30胎牛血清 10DMSO 110730-45 H5 42.5旧Express FiveSFM 42.5旧Express FiveSFM 10DMSO 310630-45 1. 用细胞计数板计数细胞。需要足够的如上表所示密度的细胞冻存 2-4 管。细胞可是悬浮或贴壁培养； 2. 将无菌冻存管立于冰上，做好标记； 3. 室温400-600g 离心10min。移除上清。H5 细胞需预留部分旧液用于制备冻存液； 4. 以给定的密度在冻存液中重悬细胞； 5. 移取 1mL 细胞悬液置于无菌冻存管中； 6. 置于-201h，然后移至-8024-48h； 7.

45、储存于液氮中。 附录 支持方案 细胞计数： 用细胞计数板计数（大部分实验室提供）或用 Invitrogen 提供的快速、简易、自动的Countess 自动细胞计数器，其可消除手动细胞计数带来的乏味和主观性。 台盼蓝计数法： - 14 -TECON TECHNOLOGY CENTER NOVA LIU 如下步骤可是你快速准确测定细胞活率。细胞活率计算是用肉眼观察到在细胞计数板上被网格分隔的活细胞总数。如果细胞染成蓝色，则是死细胞。 1. 准备0.4台盼蓝溶液，台盼蓝溶于等渗缓冲盐溶液中，pH7.2-7.3(如：磷酸盐缓冲液)； 2. 加0.1mL台盼蓝储备液至1mL 细胞中； 3. 上样至细胞计

46、数板或类似计数仪器然后在显微镜低倍镜下快速检测； 4. 数染成蓝色的细胞及所有细胞。健康处于对数生长期的细胞活率至少达 95。细胞活率=1.00-(染蓝细胞数细胞总数) 100 计算每毫升培养基中活细胞数，用如下公式。注意正确的稀释因素。 活细胞数1041.1=细胞/mL培养基 浓缩细胞： 从培养基中浓缩细胞（或从单层培养重悬细胞）： 1. 将细胞悬浮液移至适宜大小无菌离心管中 800g 离心 10min；注意:杆状病毒细胞对离心力非常敏感； 2. 小心移出悬液勿搅动沉淀； 3. 从离心管一侧轻柔加入要求体积的新鲜培养基且上下缓慢吹吸 2-3 次重悬细胞； 4. 转移至要求的无菌容器。 适应无

47、血清培养基： 如下方法能使你的细胞系适应适当的无血清环境。这个过程需要 7 天逐渐减少培养基中所含血清的量。无适应过程彻底更换无血清培养基会导致倍增时间的缩短和细胞死亡。此过程常用于H5 细胞适应除了 Express FiveSFM 以外的培养基。 注意：此方法常用于细胞适应新配方培养基。 1. 开始用对数生长期 50融合的贴壁细胞； 2. 移除 25含血清培养基 （TNM-FM） 然后加入 25无血清培养基 （如： sf-900SFM） ； 3. 细胞长至融合单层； 4. 细胞用 50含血清培养基和 50无血清培养基进行传代； 5. 细胞长至融合单层； 6. 细胞用 25含血清培养基和 75

48、无血清培养基进行传代； 7. 细胞长至融合单层； 8. 细胞传代至要求密度/用100无血清培养基稀释。 注意：在适应过程中细胞生长进度会放慢是正常的。保持细胞不低于 50融合单层有助于保持对数生长状态和减少由于生长率减慢损失的时间。 清洁转瓶: 适度保护转瓶对于细胞健康和阻止不同毒株交叉感染非常重要。杆状病毒粒子高压灭菌后任能存活。我们开发了一个方案用两个循环高压灭菌来清除转瓶培养的病毒感染。 1. 用 7清洁剂（Bellco）或 10的乙酸清 洗。边洗边旋转大约需 2h。7玻璃清洁剂微量残留对细胞无害。乙酸残留对细胞有损伤。勿用去污剂； 2. 用自来水冲 5 次； 3. 用去离子水洗5 遍； 4. 拧紧转瓶盖套好密封圈，转瓶臂上的盖子要手动拧紧； 5. 高压灭菌用去离子水循环增加湿度持续45min； 注意：如果需要可以重复此步骤； 6. 干烤45min。 细胞日志 细胞系：细胞批号/冻存日期： 复苏日期： 培养基： 培养基批号： 代次 传代时间 细胞密度 细胞活率 备注 - 15 -TECON TECHNOLOGY CENTER NOVA LIU 1 23 在备注栏记录换培养基和培养基批号及细胞状态。 疑难解答 简介： 如下部分总结了昆虫细胞培养最常见问题。细胞形态