1、简单染色与革兰氏染色,实验目的,学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法,实验原理,简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的紫色。,实验器材,菌种：苏云金芽胞杆菌、金黄色葡萄球
2、菌液体培养12-16h的枯草芽胞杆菌和培养24h的大肠杆菌 染色液和试剂：结晶紫、碘液、95%酒精、蕃红、美蓝、醇醚、香柏油 器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸（脱脂棉）、显微镜,实验方法,1 简单染色： （1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片上滴2滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的浓菌液挑2-3环涂在玻片上。每个玻片可以涂样2-4个。注意取菌不要太多。 （2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 （3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。,实验方法,1 简单染色：（4）染色：将固定过的涂片放
3、在废液缸上的搁架上，加蕃红或美蓝染色1-2min。 （5）水洗：用水洗去涂片上的染色液 （6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。 （7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。,2 革兰氏染色： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。 （2）晾干：与简单染色法相同。 （3）固定，与简单染色法相同 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1 min。 （5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。 （6）媒染：滴加碘液，媒染1 min。,2 革兰氏染
4、色： （7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色30 s左右至流出液无色，立即水洗。 （9）复染：滴加蕃红复染2 min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 （11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 （12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。,实验完毕后的处理,将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净： （1）先用脱脂棉将油镜头上的油擦去。 （2）用脱脂棉沾少许醇醚将镜头擦23次。 （3）再用干净的脱脂棉将镜头擦23次。 （4）注意擦镜头时向一个方向擦拭。,注意事项,1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。 2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。 3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。,实验报告,实验过程 绘出简单染色观察的菌体形状 绘出枯草芽胞杆菌和大肠杆菌革兰氏染色的结果 总结感想,
