1、HPLC 系统HPLC 系统基本配置由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代 HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型 HPLC 仪还备有自动馏分收集装置。最早的液相色谱仪由粗糙的高压泵、低效的柱、固定波长的检测器、绘图仪，绘出的峰是通过手工测量计算峰面积。后来的高压泵精度很高并可编程进行梯度洗脱，柱填料从单一品种发展至几百种类型，检测器从单波长至可变波长检测器、可得三维色谱图的二极管阵列检测器、可确证物质结构的质谱检测器。数据处理
2、不再用绘图仪，逐渐取而代之的是最简单的积分仪、计算机、工作站及网络处理系统。目前常见的 HPLC 仪生产厂家国外有 Waters 公司、Agilent 公司（原 HP 公司）、岛津公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。一、输液泵1泵的构造和性能输液泵是 HPLC 系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：流量稳定，其 RSD 应0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；流量范围宽，分析型应在 0.110 ml/min 范围内连续可调，制备型应能达到 100 ml/min；输出压力高，一般应能达到 150300
3、kg/cm2 ；液缸容积小；密封性能好，耐腐蚀。泵的死体积小。为了快速更换溶剂和适于梯度洗脱，泵的死体积通常要求小于 0.5mL。泵的种类很多，按输液恒定的因素可分为恒压泵和恒流泵。对液相色谱分析来说，输液泵的流量稳定性更为重要，这是因为流速的变化会引起溶质的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要依据之一。因此，恒流泵的应用更广泛。恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵。恒压泵受柱阻影响，流量不稳定；螺旋泵缸体太大，这两种泵已被淘汰。目前应用最多的是柱塞往复泵。输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。几种输
4、液泵的基本性能总结于表。几 种 高 压 输 液 泵 的 性 能 比 较名 称 恒流或恒压 脉冲 更换流动相 梯度洗脱 再循环 价格气动放大泵 恒压 无 不方便 需两台泵 不可 高螺旋传动注射泵 恒流 无 不方便 需两台泵 不可 中等单活塞往复泵 恒流 有 方便 可 可 较低双活塞往复泵 恒流 小 方便 可 可 高隔膜往复泵 恒流 有 方便 可 可 中等柱塞往复泵的液缸容积小，可至 0.1ml(Waters600E 分析型 0.1ml 在20ml/min 时最大耐压 6000psi)，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯度洗脱；改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱阻影响；泵压可达
5、400 kg/cm2（5800psi、40 Mpa）其主要缺点是输出的脉冲性较大，现多采用双泵系统来克服。双泵按连接方式可分为并联式和串联式，一般说来并联泵的流量重现性较好（RSD 为 0.1%左右，串联泵为 0.20.3%），但出故障的机会较多（因多一单向阀），价格也较贵。各品牌输液泵（分析型）的基本参数：项目 Waters 515 型 HP 1100 型 LC-10ATvp型 Elite P200 II 型 检定要 求流速范围 0.00110 0.00110 0.0019.999 0.014.99调节精度 0.001 0.001 0.001 0.01流量精密度RSD 0.1%0.15%（0
6、.3%） 0.3% 0.5% 1.5%流量准确度 2.0% 5.0% 2.0%最高压力 4000 Psi 40 MPa 39.2 MPa 40.0 MPa2泵的使用、维护注意事项为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作：防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是滤过，可采用滤膜（0.2m 或0.45m）等滤器（注意膜的选择）。泵的入口都应连接滤器。滤器应经常清洗或更换。流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在
7、停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此，必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。但此时并不会使柱内变空。输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。设定泵的上限压力(25Mpa)（3500psi）低于泵的最高使用压力，（高压泵的高压限制自动保护值不要设置
8、太高，日常分析为 2030Mpa） 。防止长期压力过高损坏泵和进样阀。设定泵的下限压力(0.51Mpa)(100-200psi)防止流动相抽干和严重泄漏.流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，同时会使信号噪音变大，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。什么是反压(back pressure)流动相流经管路及色谱柱时会有阻力,即所谓的反压，又称系统反压或系统压力正常情况下影响系统反压的主要因素:流动相的溶剂组成、温度、流速。流动相的粘度是产生反压的主要原因，有机溶剂水的粘度随组成而改变；流速对反压的影响是线性关系，流速增加，反压亦增大；温度对反压的影响是反比关系，温度升高,反压降低
9、,对某些流动相的影响更大一些。反压与填料颗粒度的平方成反比，2.5m 填料比 3.5m 填料反压高；反压与管路直径的四次方成反比(1/D4)；反压与管路的长度成正比。液相色谱系统的清洗与钝化色谱泵吸滤头,进出口阀及管路(包括进样器和检测池)若被污染,应作清洗和钝化处理,一般采用 30磷酸水溶液作为清洗剂，用 6M 硝酸作为钝化剂，先清洗再钝化。清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢，钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜清洗液用 30%磷酸水溶液配制:取 85%的浓磷酸 35ml 与 65ml 水混匀。清洗步骤如下:取下色谱柱，用两通(Union)连接进样器和检测器用纯水灌注泵
10、头(四元泵的 A,B,C,D 四路各为 25%)用 30%磷酸清洗液洗系统(1ml/min 流速)45 分钟 换成纯水洗至出口水 pH 显中性用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用钝化液用 6M 硝酸水溶液的配制:取浓硝酸 40ml 与 60ml 水混匀，钝化步骤如下:在清洗步骤完成后进行钝化处理确认清洗用的磷酸已洗净用纯水灌注泵头(四元泵的 A,B,C,D 四路各为 25%)用 6M 硝酸水溶液钝化系统(1ml/min 流速)45 分钟换成纯水洗至出口水 pH 显中性，用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用如果输液泵产生故障，须查明原因，采取相应措施排除故障：没有流动相流出，又无压力指示。原因可能是
11、泵内有大量气体，这时可打开泄压阀，使泵在较大流量（如 5ml/min）下运转，将气泡排尽，也可用一个 50ml 针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损，需更换。压力和流量不稳。原因可能是气泡，需要排除；或者是单向阀内有异物，可卸下单向阀，浸入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞，这时，可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡，或将砂滤棒浸入稀酸（如 4mol/L 硝酸）内迅速除去微生物，或将盐溶解，再立即清洗。泵中气泡的排除：打开放空阀，按仪器前面板的“冲洗”功能键，用大流量溶剂冲洗系统直到流出的液体连续，证明气泡已经排除；如果用”冲洗”状
12、态仍不能吸液，可以用吸耳球或注射器在排液口抽吸，直至液体流出；如果仍然无液体流出，可能是阀球阀座粘连，取出单向阀，向单向阀两端分别吹气，一通一堵为正常，两端均堵说明阀球座粘连，需清洗阀球阀座。 （注意仪器使用手册的描述）压力过高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。压力降低的原因则可能是管路有泄漏。检查堵塞或泄漏时应逐段分步进行。3梯度洗脱HPLC 有等度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式。等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和 pH 值等，用于分析组
13、分数目多、性质差异较大的复杂样品，此时经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。一般来讲在等度分离中，第一个峰与最后一个峰的 k比大于 30 时用梯度才可能有较好的结果。可心粗略地估计一下，梯度洗脱中所有的峰有相同的 K值和相同的峰宽。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。在液相色谱中流速（压力）梯度和温度梯度（在 GC 常用）中效果不大，而且还会带来一些不利影响，因此，液相色谱中通常所说的梯度洗
14、脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度（外梯度）只需一个高压泵，与等度洗脱输液系统相比，就是在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。因为比例阀是在泵之前，所以是在常压（低压）下混合，在常压下混合往往容易形成气泡，所以低压梯度通常配置在线脱气装置。近几年常见的是来自于四种溶液瓶的四根输液管分别与真空脱气装置的四条流路相接，经脱气后的四种溶液进入比例阀，混合后从一根输出管进入泵体。多元梯度泵的流路可以部分空置。高压梯度（内梯度）。一般只用于二元梯度，即用两个高压泵分别按设定的比例输送 A 和 B 两种溶液至混合器，混合器是在泵之后，即两种溶液
15、是在高压状态下进行混合的。在过去的 80、90 年代是基本配置。当时的主要问题是在线脱气无法实现，只能使用氦脱气。高压梯度系统的主要优点是，只要通过梯度程序控制器控制每台泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，易于实现自动化控制。其主要缺点是使用了两台高压输液泵，使仪器价格变得更昂贵，故障率也相对较高，而且只能实现二元梯度操作（目前有四元的，如 SSI） 。两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必
16、须充分重视：要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。因此要注意
17、防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。需让 1030 倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。也造成液相梯度不如气相使用的频率高。梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）二、进样器HPLC 进样方式可分为：隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。1隔膜进样。用微量注射器将样品注入专门设计的与
18、色谱柱相连的进样头内，可把样品直接送到柱头填充床的中心，死体积几乎等于零，可以获得最佳的柱效，且价格便宜，操作方便。但不能在高压下使用（如 10MPa 以上）；此外隔膜容易吸附样品产生记忆效应，使进样重复性只能达到 12%；加之能耐各种溶剂的橡皮(隔膜)不易找到，常规分析使用受到限制。2停流进样。可避免在高压下进样。但在 HPLC 中由于隔膜的污染，停泵或重新启动时往往会出现“鬼峰”；另一缺点是保留时间不准。在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中，效果较好。3阀进样。目前 HPLC 分析常用六通进样阀（以美国 Rheodyne 公司的7725 和 7725i 型最常见），其关键部件由圆形密封
19、垫（转子）和固定底座（定子）组成。由于阀接头和连接管死体积的存在，柱效率低于隔膜进样（约下降510%左右），但耐高压（3540MPa），进样量准确，重复性好（0.5%），操作方便。六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的 50%（最多 75），并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注射器取样的熟练程度，而且易142356 u u d 142356 u u产生由进样引起的峰展宽。用完全装液法进样时，进样量应不小于定量环体积的 510 倍（最少 3 倍），这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复
20、性。原则上进样量最好选用定量环的量，以避免由于进样不准而引起的偏差。定量环可进行更换。六通阀使用和维护注意事项：样品溶液进样前必须用 0.45m 滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。严禁使用气相色谱那样的尖头针进样。一般的使用方法1.在进样状态下清洗针口2.在装填状态下插入微量注射器3.注入样品4.切到进样状态便捷的使用方法（不需清洗）1.进样
21、状态下插入微量注射器（即在上次进样后不取下微量注射器，但易损坏针）2.切到装填状态3.注入样品4.切回到进样状态4自动进样 用于大量样品的分析。自动进样器(717Plus 和 2695 样品管理系统):注意:样品瓶中应有超过 13 瓶高度的样品量；使用内衬管(Insert)时应设定针高度为 2mm(2695)或 75%高度(717Plus)进样器的清洗:进样针是流路的组成部分,运行中一直由流动相清洗，进样针外部由软件控制在每次进样前用洗针液清洗，洗针溶剂根据使用的流动相的不同而不同。若注射器内出现气泡，用面板操作的 Purge Inject 功能清除之。洗针溶剂瓶(内放绿色塑料管)不要放在仪器
22、的上部，应放于与仪器同一水平面的实验台上三、色谱柱 色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。市售的用于 HPLC 的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等，其粒度一般为 3,5,7,10m等，（对 UPLC 所用色谱柱可有 1.7、2.1m）柱效理论值可达 516 万/米。对于一般的分析只需 5000 塔板数的柱效；对于同系物分析，只要 500 即可；对于较难分离物质则可采用高达 2 万的柱子，因此一般 1030cm 左右的柱长就能满足复杂混合物分
23、析的需要。柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率，除柱外死体积要小外，还要有合理的柱结构（尽可能减少填充床以外的死体积）及装填技术。即使最好的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起 30 倍粒径的厚度。在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。1柱的构造色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，压力不高于 70 kg/cm2 时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。为
24、提高柱效，减小管壁效应，不锈钢柱内壁多经过抛光。这也是柱一般不回收充填的原因。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度，其效果与抛光相同。还有使用熔融硅或玻璃衬里的，用于细管柱。色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，孔径 0.220m(510m)，取决于填料粒度，目的是防止填料漏出。色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类，尺寸规格也不同：常规分析柱（常量柱），内径 25mm（常用 4.6mm，国内有 4mm 和 5mm），柱长1030cm；窄径柱（narrow bore，又称细管径柱、半微柱 semi-microcolumn），内径 12mm，柱长 1020cm；毛细管柱（
25、又称微柱microcolumn），内径 0.20.5mm；半制备柱，内径5mm；实验室制备柱，内径 2040mm，柱长 1030cm；生产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。空柱各组件均为 316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。2柱的发展方向因强调分析速度而发展出短柱，柱长 310cm，填料粒径 23m。为提高分析灵敏度，与质谱(MS)联接，而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于 0.2mm 的微径柱（microbore）。细管径柱
26、的优点是：节省流动相；灵敏度增加；样品量少；能使用长柱达到高分离度；容易控制柱温；易于实现 LC-MS联用。但由于柱体积越来越小，柱外效应的影响就更加显著，需要更小池体积的检测器（甚至采用柱上检测），更小死体积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能：输液泵能精密输出 1100l/min 的低流量，进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。且因上样量小，要求高灵敏度的检测器，电化学检测器和质谱仪在这方面具有突出优点。3柱的填充和性能评价色谱柱的性能除了与固定相性能有关外，还与填充技术有关。在正常条件下，填料粒度20m 时，干法填充制备柱较为合适；颗粒20m 时，湿法填充较为理想。填充方法
27、一般有 4 种：高压匀浆法，多用于分析柱和小规模制备柱的填充；径向加压法，Waters 专利；轴向加压法，主要用于装填大直径柱；干法。柱填充的技术性很强，大多数实验室使用已填充好的商品柱。必须指出，高效液相色谱柱的获得，装填技术是重要环节，但根本问题还在于填料本身性能的优劣，以及配套的色谱仪系统的的结构是否合理。无论是自己装填的还是购买的色谱柱，使用前都要对其性能进行考察，使用期间或放置一段时间后也要重新检查。柱性能指标包括在一定实验条件下（样品、流动相、流速、温度）下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性，或分离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复性在5%或1
28、0%以内。进行柱效比较时，还要注意柱外效应是否有变化。一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数，如柱长、内径、填料的种类、粒度、色谱柱的柱效、不对称度和柱压降等。对于色谱工作者一根好的反相色谱柱可从以下几个方面予以评价：合适的选择性：满足不同的分离要求，也可以说根据分离样品的不同选择合适的色谱柱。色谱实验结果揭示：不同的色谱柱由于疏水性不同、残留硅羟基活性不同而造成色谱行为不同。此源于色谱柱不同 C18 配体键合水平（状况） ，配体覆盖率，硅胶颗粒基质的密度，表面积，孔径、纯度不同良好的色谱行为：这是购买到一只色谱柱所关心的。好的色谱峰形才能使我们得到更好的定量精度、灵敏度与分离度更准确与精
29、确的定量结果-纯度分析-稳定性分析更高的灵敏度更好的检出限与定量限对低浓度杂质有更强的检测能力更好的分离度更有利于相邻色谱峰的分离重现性：色谱柱间重现性与批次间重现性，这可以反映一个品牌的质量的稳定性。重现性是液相色谱分析的基本要求，缺乏重现性是最担心的问题，重现性好可加快方法验证(Validation)的速度，确保长期符合认证及系统适应性等要求。在色谱系统之间以及实验室之间更容易传递方法。更容易符合法规要求。重现性包括：同一批次合成的填料色谱柱之间的重现性。其决定于柱床填充质量控制、色谱峰对称性、反压、有无选择性差异不同批次合成的填料色谱柱批次间重现性。其决定于颗粒的物理化学性质及表面性质（
30、Waters 的指标）孔径：RSD = 3%；渗透性：RSD = 2%；特征表面积：RSD = 2%；平均颗粒度：RSD = 2%宽应用范围：主要指 pH 范围和温度范围4.色谱柱的安装：a、拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂，仔细阅读产品说明书。b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。c、按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为 1.57mm、内径为 0.1-0.3mm 的不锈钢管也可用 PEEK 管，agilent0.17mm。连接管的两端均有空心螺钉
31、及密封用压环或使用 PEEK 刃环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用扳手继续顺时针拧14-12 圈，切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧 14 圈，直至不漏液为止。5柱的使用和维护注意事项色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。色谱柱在使用前，在您自己的液相色谱仪上进行柱的性能测试，并将结果保存起来，以作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时最好是按
32、照色谱柱出厂报告中的样品和条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。样品的前处理：a、最好使用流动相溶解样品。如溶样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出。了解样品与色谱柱的基质/填料是否有相互作用。b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。c、使用 0.45m 的过滤膜过滤除去微粒杂质。以免造成层析柱的高背压，并缩短层析柱的正常使用寿命。进样量和浓度柱子的最大载样量取决于：柱子的型号，使用的条件和样品的类型。很难给出一个一般的指示。对于进样体积的建议则比较容易（见表中的典型值） 。注射了太大体积或太浓的样品会
33、使峰展宽或者峰融合。柱尺寸长度*内径最大样品体积2502.0mm 10l2003.0mm 15l2504.6mm 50l25010.0mm 250l流动相流速的选择：因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm 的色谱柱，流速一般选择 1mlmin，对于内径为 4.0mm 柱，流速0.8mlmin 为佳。 流量参考表柱内径（毫米） 流速（ml/min）最佳 最高2.0 0.2 1.03.0 0.4 2.04.6 1.0 4.010.0 4.7 18.0注意：最高压力：一般来讲，不锈钢柱：4500ps
34、i；玻璃柱：3000psi增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止填充床的扰动。如果想更换柱子，要降低流量至 0，等洗脱液完全流出柱子为止（2 分钟） 。拆除柱子而没有等待压力的降低会损坏柱子。高柱压的产生一般是由于不正确地使用柱子的结果。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲击柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进
35、样时阀的转动不能过缓（如前所述）。 应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。 一般来说，色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。但是柱效极度下降或即将报废的柱子只有反冲才能延长使用寿命。 使用适宜的流动相（尤其是 pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。 避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱
36、一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的 20 倍左右，即常规分析需要 5075ml。下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：色谱柱的清洗或色谱柱的再生进行色谱柱清洗或再生时，应使用一个廉价的泵，我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。注意，对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗清洗：清洗硅胶柱的一般方法：先用甲醇洗去极性杂质再用干燥的二氯甲烷、正庚烷 100200ml 依次活化清洗键合相柱(烷基)的一般方法
37、：20 倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗建议用来冲洗的溶剂体积色谱柱尺寸 柱体积 所用溶剂的体积（一般讲是 20 倍柱体积） 125-4 1.6ml 30ml250-4 3.2ml 60ml 再生：再生反相色谱柱1.首先倒转柱子。2.以大约最佳流速的 40%的流速冲洗柱子大约 45-60 分钟，使用的溶剂的顺序要按照水甲醇异丙醇二氯甲烷异丙醇甲醇水进行。二氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射 100200l 四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脱能除去蛋
38、白质污染3.柱子转回正常方向，使用分析所用洗脱液平衡。注意：在使用另外的淋洗方法的时候，一定要先用水开始冲洗以去除缓冲液，保证其后的洗脱液可以混溶。再生硅胶柱1.首先倒转柱子。2.以大约最佳流速的 40%的流速冲洗柱子大约 45-60 分钟，使用的溶剂的顺序要按照异辛烷（或己烷）乙酸乙酯干燥的异辛烷（或己烷）进行。也可以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。3.柱子转回正常方向，使用分析所用洗脱液平衡。再生极性键合柱（如 Si，NH2 基色谱填料）取决于使用的条件，可以使用反相的条件，也可
39、以使用硅胶柱的条件。0.05M 稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有机物）、甲醇、水依次冲洗。 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。 色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢铲将柱头填料取出12
40、mm 高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱530mm），可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。通常色谱柱寿命在正确使用时可达 2 年以上。以硅胶为基质的填料，只能在 pH29 范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使
41、柱效恢复。在导致高压液相层析柱失效的四种常见因素（堵塞、无效孔隙、样本吸附以及化学侵蚀）中，层析柱堵塞是引起柱压升高的主要原因，也是困扰分析化学家和分析化验员的最常见问题。微粒堵塞（样品、流动相、密封垫） 、柱床膨胀、不可逆吸附、细菌生长都可以引起柱压升高。每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如 ODS 柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、溴）的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在 HPLC 仪上的柱子如不经常使用，应每隔 45 天开机冲洗 15 分钟。每天用足够的时间来处理色谱柱，您就会在实验时获得最大
42、的“补偿“，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！- 一定得做！介绍特殊分析柱使用手册几个问题1.为什么柱效低 a.色谱柱被污染 b.过滤片部分堵塞。主要因为样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞 c.色谱柱内的死体积(流动相 pH 值及组成不合适造成固定相流失；流速急剧变化造成固定相物理损坏；机械震动造成柱床产生裂缝；柱床收缩或干涸)2.重复性差、回收率低实验的重复性差 a.色谱柱被污染 b.流动相 pH 值及组成不合适造成键合相流失 c.样品溶剂不同或样品本身不稳定。回收率低，不出峰 a.“不可逆”吸附 b.固定相过强或流动相过弱 c.非特异性吸附。3.色谱柱以外的因素“柱效”问题，不一定是
43、色谱柱问题！其他可能：系统连接问题：连接不好造成死体积进样器检测器管路，连接口保护柱在线过滤器堵塞流动相问题（色谱柱未平衡好进样量太大）柱压过高，也不一定是色谱柱问题！如系统反压问题-阻尼器堵塞-进样器堵塞-管路或连接口堵塞-在线过滤器不干净-保护柱压力传感器不准确流速是否错误?实验的重复性差也可能由于梯度实验时平衡时间不足温度波动流动相组成改变样品溶剂不同样品稳定性不好方法开发不好等引起-缓冲液的pH 值不合适-缓冲液的缓冲能力不足。（简单的判别方法高的柱反压是否伴随着保留时间变化? 峰形变坏? 分辨率变坏? 测量色谱系统的谱带展宽典型的分析系统应远小于 100 微升如大于此数应检查仪器系统
44、）颗粒物积聚在烧结物或者树脂床上（它们都会使背压增高） 。如果柱压增高了，将柱子与进样器断开，运行泵，以验证背压的来源确实是来自柱子的颗粒污染（样品、洗脱液和系统）倒转柱子，以反向的流动来冲洗柱子。如果这样不能解决问题，更换进口过滤器或者筛板。4.存放前的处理除去杂质、缓冲盐；选择合适的存放溶剂；避免色谱柱床的干涸；避免机械震动；防止细菌生长；注意存放的温度。5. 色谱柱的平衡 反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉，因此在用流动相分析样品之前，应使用 1020 倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果您所使用
45、的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水“过渡“。硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相，在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡如何平衡色谱柱？ 平衡过程中，将流速缓慢地提高，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂浓度如果较低，则需要较长的时间来平衡）四、检测器检测器是 HPLC 仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。HPLC 的检测器要求灵敏度高、噪音低（即对温度、流量等外界变化不敏感）、线性范围宽、重复性好和适用范围广。1分类1）按原理可分为光学检测器（如紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射）、热学检测器（如吸附热
46、）、电化学检测器（如极谱、安培）、电学检测器（电导、介电常数、压电石英频率）2）按测量性质可分为通用型和专属型（又称选择性）。通用型检测器测量的是一般物质均具有的性质，它对溶剂和溶质组分均有反应，如示差折光、蒸发光散射检测器。通用型的灵敏度一般比专属型的低。专属型检测器只能检测某些组分的某一性质，如紫外、荧光检测器，它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应。3）按检测方式分为浓度型和质量型。浓度型检测器的响应与流动相中组分的浓度（UV、示差折光等）有关，质量型检测器的响应与单位时间内通过检测器的组分的量（MS）有关。4）检测器还可分为破坏样品（MS）和不破坏样品（UV、示差折光等）两种。2性能
47、指标1）噪音和漂移：噪音 没有样品时检测器的最大输出信号。漂移 检测器在一段时间内响应值的变化。在仪器稳定之后，记录基线1小时，基线带宽为噪音，基线在1小时内的变化为漂移。它们反映检测器电子元件的稳定性，及其受温度和电源变化的影响，如果有流动相从色谱柱流入检测器，那么它们还反映流速（泵的脉动）和溶剂（纯度、含有气泡、固定相流失）的影响。噪音和漂移都会影响测定的准确度，应尽量减小。2）灵敏度(sensitivity)：灵敏度 S = R / QR是检测器响应值的增量Q是样品量的增量表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。对浓度型检测器，它表示单位浓度的样品所产生的电信号的大小，单位为
48、mVml/g。对质量型检测器，它表示在单位时间内通过检测器的单位质量的样品所产生的电信号的大小，单位为 mVs/g。3）检测限(detection limit)检测器灵敏度的高低，并不等于它检测最小样品量或最低样品浓度能力的高低，因为在定义灵敏度时，没有考虑噪声的大小，而检测限与噪声的大小是直接有关的。检测限指恰好产生可辨别的信号（通常用 2 倍或 3 倍噪音表示）时进入检测器的某组分的量（对浓度型检测器指在流动相中的浓度注意与分析方法检测限的区别，单位 g/ml 或 mg/ml；对质量型检测器指的是单位时间内进入检测器的量，单位 g/s 或 mg/s）。又称为敏感度(detectabilit
49、y)。D2N/S，式中 N 为噪声，S 为灵敏度。通常是把一个已知量的标准溶液注入到检测器中来测定其检测限的大小。检测限是检测器的一个主要性能指标，其数值越小，检测器性能越好。值得注意的是，分析方法的检测限除了与检测器的噪声和灵敏度有关外，它实际上还与色谱条件、色谱柱和泵的稳定性及各种柱外因素引起的峰展宽有关。是一项综合性指标。信噪比：S/N 亦如此4）线性范围(linear range)：指检测器的响应信号与组分量成直线关系的范围，即在固定灵敏度下，最大与最小进样量（浓度型检测器为组分在流动相中的浓度）之比。也可用响应信号的最大与最小的范围表示，例如 Waters 996 PDA 检测器的线性范围是-0.1
