1、实验二 显微镜的使用与维护,实验目的 实验器材 显微镜的基本结构 实验原理 实验步骤 实验报告,实验内容,一、实验目的,学习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。 掌握油镜的原理和使用方法。 观察常见微生物标本并绘图。,二、实验器材,1.微生物制片标本。 2. 溶液或试剂：香柏油、二甲苯 。 3. 仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等。,三、显微镜的基本结构,现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由光学系统和机械装置两大部分组成。,显微镜的构造,显微镜的结构图,三、显微镜的基本结构,（一）显微镜光学系统显微镜光学系统主要包括物镜、目镜、反射镜和
2、聚光器四个部件。1.物镜：因为它靠近被观察的物体（标本），因此叫做接物镜，通常物镜又称为镜头，安装在镜筒的下端。把放大倍数为10倍以下的物镜叫做低倍镜，20倍左右的物镜叫做中倍物镜，4045倍物镜叫做高倍物镜；浸液物镜一般常用的是油浸物镜，简称油镜，油镜放大倍数为90100，使用油镜时在标本上加一滴折射率大于1的液体作为介质，一般用的是香柏油，其折光率为1.515。2.目镜：因为它靠近观察者的眼睛，所以叫接目镜。其作用相当于一个放大镜，把物镜放大的实象进一步放大。,三、显微镜的基本结构,3.聚光器：聚光器也叫集光器，主要由聚光镜和可变光兰组成。 （1）聚光镜：聚光镜由一片或数片透镜组成。其作用
3、相当于凸透镜，起聚光的作用，这样能增强标本的照明。 （2）可变光兰：可变光兰也叫光圈，位于聚光镜的下方，由十几张金属薄片组成，中心部分形成圆孔。推动可变光兰的把手，可以任意调节圆孔的大小，其作用是调节光强度和使聚光镜的数值孔径与物镜的数值孔径相适应。可变光兰开得越大，镜口角越大，则数值孔径越大，反之亦然。 4.反射镜：反射镜装在聚光器下面的镜座上，可在水平与垂直两个方向上任意旋转。反射镜一面是平面镜，另一面是凹面镜，反射镜的作用是使光源发出的光或天然光射向聚光镜器，光强时，用平面镜，光弱时用凹面镜。,三、显微镜的基本结构,（二）显微镜的机械装置显微镜的机械装置是显微镜的主要组成部分，机械装置的
4、作用是固定与调节光学镜头。固定与移动标本等。显微镜的机械装置，主要有镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器和调焦装置等组成。1.镜座：镜座是显微镜底座，多呈马蹄型或长方形，它的作用是支撑整个显微镜。2.镜臂：在镜座上面和镜筒后面，呈圆弧形，为显微镜移动。3.镜筒：在显微镜前方上部是一个金属制空心圆筒，光线可从此通过。圆筒的上端可插入目镜，下端有螺纹与旋转器相连，从镜筒下端螺纹口到上端接目镜的距离称镜筒，长一般为160毫米。,三、显微镜的基本结构,4.旋转器：在镜筒下端与螺纹口相连接，有34个孔，备装不同放大倍数接物镜，根据需要可旋转更换不同的物镜。5.载物台：在镜筒下方，呈方形或圆形，中间有孔可透过光线
5、。台上有用来固定标本的夹子。台上装有标本移动器，是移动标本的机械装置，由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成，在纵横架杆上有刻度标尺，构成很密切的平面座标系。6.调焦装置：显微镜上装有粗调节器和细调节器，用粗调节器作粗略调焦，调到隐约看到标本为止，然后用细调节器作精确调焦，使观察的标本最清晰。,四、实验原理,在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有下二方面的原因：增加照明亮度增加显微镜的分辨率,四、实验原理,（一
6、）增加照明亮度油镜的放大倍数可达 100 ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同，有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（ n=1.55 ）相仿的油镜（通常用香柏油，其折射率 n=1.52）。,四、实验原理,（二）增加显微镜的分辨率显微镜的分辨率或分辨力是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。分辨力D可表示为：D=/2N.A= 光波波长（ 0.4-0.7 m ）NA= 物镜的数值孔径值数
7、值孔径NA值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为： NA= n sin ,四、实验原理,为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最大只能达到 120。n 为介质折射率。由于香柏油的折射率（ 1.52 ）比空气及水的折射率（分别为 1.0 和 1.33 ）要高，因此以香柏油作为镜头与玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值（NA 一般在1.2-1.4）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（ NA 都低于 1.0）。若以可见光的平均波长 0.55 m来计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4m的物体，而油镜的分辨率却可达到 0.2 m
8、 左右。,五、实验步骤,（一）显微镜的操作 1、从镜筒箱内取显微镜用右手握紧镜臂，左手托住镜座，轻轻地放在胸前的实验台上，使显微镜正对光源（镜内有照明装置者则不必）。 2、把聚光器上升到上端透镜平面稍低于载物台的刻度，将可变光兰开到最大。 3、逆时针方向转动粗调节器，使镜筒上升，再转动物镜转换器，把低倍镜转到工作的位置。即对准载物台的光孔。 4、顺时针方向转动粗调节器，使镜筒慢慢下降，从左侧注意低倍镜距载物台1厘米处停住。,五、实验步骤,5、用左眼接近目镜观察，同时调节光源，使光线射入物镜。调节聚光镜和可变光兰，使视野内得到最亮和最均匀的照明。用低倍镜时，聚光器可适当降低，光强时可变光兰可适当
9、缩小，用高倍镜或油镜时，聚光镜可适当调高，可变光兰孔可适当放大。 6、将标本片放在载物台上，此时转动粗调节器使物镜接近标本片而保持适当距离，再逆时针转动粗调节器使镜筒慢慢上升，用左眼仔细观察视野的变化，若发现有物象闪过，则略回转到模糊物象，即改用细调节器，往返旋转，直至物象最清晰，移动载玻片进行观察。,五、实验步骤,7、在低倍镜找到清晰物象后，要进一步观察内部结构，可移动物镜转换器，转换高倍镜或油镜，再行调焦，观察到清晰物象为止。高倍镜距载玻片1毫米，使用油镜首先在标本上加上一滴香柏油，油镜距载玻片1毫米以下而又未与载玻片相碰的距离。在使用高倍物镜和油镜时倍加注意切勿与载玻片相碰，而造成镜损事
10、故。 8、观察完毕，将镜筒升高。取下载玻片，使用油镜时以擦镜纸将油用二甲苯擦净。将物镜旋至八字形后，降至接近载物台，以纱布擦净显微镜镜身后放入箱内。,五、实验步骤,（二）显微镜保养和使用中的注意事项 1、不准擅自拆卸显微镜的任何部件，以免损坏。镜筒上必须插上目镜，以免灰尘进入镜筒内。 2、镜面只能用擦镜纸或绸布擦，不能用手指或粗布擦，以保证镜面的光洁度。用过油浸镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭23次，最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。 3、观察标本时，必须依次用低倍镜、高倍镜最后用油镜，当目视接目镜时，切不可使用粗调螺旋来下降镜筒，尤其是使用油镜时更应注意这一点，以免物镜碰到玻片损伤镜面或压碎玻片。 4、观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳。并且能够在左眼观察时，右眼注视着绘图。 5、拿显微镜时，一定要右手拿显微镜，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿动。,六、 实验报告,1.分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的微生物的形态。 2.思考题 （1）用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？ （2）试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？ （3）影响显微镜分辨率的因素有哪些？,
