1、生物电镜在肝病研究中的应用 (白求恩医学院 临床七年四班 孟庆东 70100447)摘 要电子显徽术已成为研究生命和人类疾病的重要手段。本文对电子显微术在肝病研究领域中的应用情况作了综述, 着重介绍了在肝病临床诊断、肝炎的研究、多种理化因素对肝细胞超微结构的影响中所做的贡献。本文通过查阅多种文献资料，对电镜技术在肝脏病变研究中的作用进行综述。关键词：生物电镜；肝病研究；超微结构一.前 言从 20 世纪 30 年代开始，随着电子显微技术的问世，人们能在原子的尺度上观察研究物质的结构，使人们的对物体的观察由宏观世界进入了原子级的微观世界。目前的电镜种类很多，有透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)
2、、扫描隧道电镜、原子力电镜等，但应用于临床病理诊断中的主要是透射电镜和扫描电镜。前者注重组织核细胞内的超微结构，后者则用于观察组织和细胞内的表面形貌。经过 80 余年的发展，电子显微镜技术已成为医学科学领域内不可缺少的研究手段及工具，对医学科学研究起着重要作用。临床病理诊断为最终诊断，目前电镜诊断技术已广泛应用于现代临床病理诊断中，特别是在传统的临床诊断手段无法确诊的病例，电子显微镜发挥着重大作用。二.生物电镜在肝病诊断中的应用随着电镜技术的发展，以前无法明确通过病人表征或光镜诊断和辨别的疾病已经可以在电镜下一览无余，电镜技术为一些难以确诊的疾病提供了丰富的科学依据，为医学的进步和发展做出了巨
3、大贡献。下面本文主要介绍 Gilbert 综合征、糖尿病(DM)、肝豆状核变性活检组织中肝脏超微结构的改变。（1） Gilbert 综合征 Gilbert 综合征的肝组织表现不一。某些肝活检标本，可发现血窦面肝细胞膜改变，细胞表面变平滑、微绒毛消失，Disse 间隙胶原纤维增加；某些患者，可出现巨大线粒体，常含有增多，副晶格样包涵体、较明显的基质致密颗粒。肝细胞常见脂褐素颗粒多分布于毛细胆管周围肝细胞内，可单独出现或伴随其他改变。Gilbert 综合征的色素颗粒大小不等，卵圆形或不规则形并含有电子致密块状颗粒，与电子密度略低的聚集物以及脂滴互相混杂。这些溶酶体颗粒的基质由细小的、弱嗜锇性的颗粒
4、组成。少数颗粒类似 Dubin-Johnson 综合征的颗粒，但颗粒较小，缺少致密核芯结构。Gilbert 综合征需与其他遗传性高胆红素血症鉴别，如 Crigler-Najjar 综合征、Dubin-Johnson 综合征和 Rotor 综合征。Crigler-Najjar 综合征的超微结构改变中肝细胞缺少脂褐素、Kupffer 细胞有胆色素沉积，Dubin-Johnson 综合征有特殊的含致密核芯结构的溶酶体，Rotor 综合征除含双色调溶酶体外，还可出现毛细胆管发育不良等表现，可资鉴别。此外，还应排除溶血性黄疸，特别是遗传性球形红细胞增多症，可通过扫描电镜检查红细胞形态进行确诊。有时Gil
5、bert 综合征还可合并遗传性球形红细胞增多症，更要注意鉴别诊断。对于急、慢性肝炎后出现的肝炎后高胆红素血症，尤其是非结合胆红素持续或反复增高的病例应注意有无Gilbert 综合征的背景1，2。（2 ） 糖尿病 RER 脱颗粒在血脂高的 DM 组更明显, 这种病变导致脂蛋白合成障碍, 内质网合成甘油三酯贮积增加。与临床上 DM 患者常合并脂代谢异常特别是高甘油三酯血症和脂肪肝相吻合。另外 DM 组中,SER 易见 , 与糖原颗粒相伴随并扩张。现已证实 SER 含有葡萄糖- 6- 磷酸酶, 可将葡萄糖- 6- 磷酸裂解, 引起血糖升高 162。DM 组光镜下所见核内空洞经电镜证实为核内糖原颗粒,
6、 系糖原在福尔马林固定过程中溶解消失而成。故今后可省略 PAS、消化后 PAS 及脂肪染色等繁琐步骤。从光、电镜所见并与对照组比较, 显示核内糖原是DM 肝最具特征性的改变。肝细胞内脂肪或糖原堆积是致 DM 肝肿大的主要原因。二者的鉴别非常重要,因脂肪变性可致肝纤维化和肝硬化, 而糖原堆积不会。DM 组肝间质有纤维化, 另有 5 例患者间质贮脂细胞增多。近来研究证实 , 贮脂细胞是一种特殊状态的成纤维细胞, 病理情况下可转化为合成胶原活跃的成纤维细胞, 与肝纤维增生性病变的发生和发展密切相关 162。间质纤维化及贮脂细胞增多均从组织学上预示 DM 肝脏病变与肝硬化有关。总之, 因 DM 组肝功
7、能及 B 超与病理改变的严重程度之间无明显相关, 且病理改变更突出, 具有确诊 DM 肝的特征性改变, 故要确诊 DM 肝病, 最好能行肝穿活检证实3,4 。（3 ）肝豆状核变性活检肝豆状核变性的细胞器损伤, 最特征性的改变是线粒体的形态改变和脂滴的存在5 。肝豆状核变性的早期表现为线粒体病变、脂肪变性及毛细胆管内淤胆; 中期的表现为细胞核损伤、内质网损伤、溶酶体和残余小体出现; 晚期表现为细胞完全破坏, 高电子密度的残余体出现, 胶原纤维增生。线粒体损伤早期就可以出现 , 在肝细胞内, 线粒体是自由基作用的最重要靶器官, 脂质过氧化反应的结果, 会因为消耗大量的不饱和脂肪酸使膜结构损害, 导
8、致线粒体膨胀、脆性增加和通透性增加。纤维化前缺乏特征改变, 以肝细胞的退行性变、脂肪变性, 门脉周围脂褐素沉积, 核空泡样变为主要特点; 后期的病理改变主要表现为不同程度的肝纤维化和肝硬化。在同一个标本中可见肝细胞不同阶段的病变。线粒体异常是肝豆状核变性的早期特异性表现之一, 但是并不仅仅出现在肝豆状核变性的肝组织内, 也常常出现在体质性黄疸等疾病的肝细胞内, 临床诊断需结合电镜、血中铜离子浓度和铜蓝蛋白检查, 必要时检查 K-F 环, 以提高确诊率。所以, 对怀疑为肝豆状核变性的患者, 进行肝活体组织的电子显微镜检查是临床早期发现、早期诊断的有效手段6。三肝炎的研究根据流行病学调查，甲型肝炎
9、的感染常因年龄与地区的不同而异，年龄越大，感染率越高，且农村高于城市，一般为 50%80%。据此推算，中国有 7 亿8 亿人感染过甲型肝炎。乙型肝炎的感染率，根据对黑龙江、河北、河南及湖南四省 10484 人的调查发现为 58%。据此推算，有 6 亿7 亿人感染过乙型肝炎。至于丙型肝炎，在中国尚无确切的流行病学调查资料。但在输血后的肝炎中，国内为 60%80%。丁型肝炎几乎都发生在乙型肝炎病毒感染的基础上。根据对全国 17 个地区 1764 例血清乙型肝炎表面抗原阳性患者肝组织开展的检查发现，丁型肝炎抗体阳性者有 167 例，检出率为 9.47%。可见，肝炎的研究与突破已迫在眉睫。下面本文对几
10、种肝炎在超微结构伤的改变与鉴别进行总结。（1） 慢性肝炎在慢性肝炎患者中促凋亡蛋白明显高于抑凋亡蛋白, 这和一般肿瘤细胞抑凋亡蛋高于促凋亡蛋白恰明显相反。近年的研究指出, 凋亡途径可以区别为两型 : 由细胞表面的 Fa S 及其配体 Fas L 相结合或由 TN F 及其受体 TN FR 相结合而开始的凋亡被称为外源性凋亡( 或 I 型凋亡)。但凋亡亦可不以表面的配体或受体而发生, 当细胞 D NA 受损破坏时,细胞内的肿瘤抑制因子 p53 可被激活而使山、蛋白移行于线粒体并使线粒体外膜形成孔, 使线粒体内膜和外膜间的基质泄于肝细胞浆内而促成了凋亡, 这一途径称之为内源性凋亡(或 1 型凋亡)
11、。鉴于实验证明肝细胞凋亡时 Bc l 一 2 族的过度表达及 Bi d 基因的被清除等现象都使 I 型凋亡途径受阻,故肝细胞的凋亡被视为由 P5 3 经由线粒体而产生的内源性凋亡(1 型凋亡)。慢性肝炎时的细胞凋亡机制应该进一步研究, 以有利于今后该病的治疗7。(2)乙型肝炎40 例慢性乙型肝炎患者，血清 HBV DNA 水平和肝组织某些超微结构损伤（线粒体肿胀、溶酶体增多、汇管区淋巴细胞浸润、Kupffe 细胞增生、肝细胞淤胆和间质纤维组织增生）呈正相关，但不呈直线相关（r =0.21，t =1.12，P0.05） ；血清 HBV DNA 水平和肝组织某些超微结构损伤（内质网增生扩张、高尔基
12、体扩张、贮脂细胞增生、毛细胆管扩张淤胆、毛细血管增生）无相关性（P0.05） 。血清 HBV DNA 定量 PCR 法可真实反映乙型肝炎病毒感染、复制及病程变化。在临床上动态检测慢性乙型肝炎患者血清 HBVDNA 含量，有利于动态了解其肝组织某些超微结构损伤（线粒体肿胀、溶酶体增多、汇管区淋巴细胞浸润、Kupffe 细胞增生、肝细胞淤胆和间质纤维组织增生）变化；但是同时也提示：不能够通过此法动态了解其肝组织另外一些超微结构损伤（内质网增生扩张、高尔基体扩张、贮脂细胞增生、毛细胆管扩张淤胆、毛细血管增生） 。由于乙型肝炎患者血清 HBV DNA 水平和肝组织某些超微结构损伤（线粒体肿胀、溶酶体增
13、多、汇管区淋巴细胞浸润、Kupffe 细胞增生、肝细胞淤胆和间质纤维组织增生）不呈直线相关，所以不能通过慢性乙型肝炎患者血清 HBV DNA 含量水平来妄加推测其肝组织某些超微结构损伤（线粒体肿胀、溶酶体增多、汇管区淋巴细胞浸润、Kupffe 细胞增生、肝细胞淤胆和间质纤维组织增生）的具体水平。HBV-DNA 是病毒复制和传染性的直接标志。HBV DNA 含量水平测定对于判断乙型肝炎病毒复制程度、传染性大小，抗病毒药物疗效，病情变化和预后，为调整抗病毒药物剂量、确定疗程，可以提供可靠依据8,9,10。（3）输血后丙型肝炎过去大多认为肝细胞的改变均具有非特异性，与慢性乙型肝炎肝组织的改变几乎相似
14、且无明显鉴别特征。本材料所见肝细胞间隙增宽，胞质密度降低，肝细胞内线粒体缩小，形态异常。PTH-C 超微结构可见狄氏腔炎细胞浸润，肝细胞腔隙有胶原沉积，储脂细胞多见。大量的浸润细胞将产生大量的淋巴因子，促使胶原增生对肝细胞产生毒性，从而引起肝损伤并导致炎症慢性化及纤维化。HCV 免疫组化和原位杂交显示多数肝小叶呈阴性反应，阳性细胞数量减少，多成散在性分布；HCVRNA 多存在于肝小叶的肝细胞，并可见枯否氏细胞，单核细胞，窦襞内皮细胞，及胆管上皮细胞。由于 HCV 的感染水平很低，感染人群血液循环中的 HCVRNA 含量波动是一般的免疫组化和原位杂交很难检测出来的，但低含量HCVRNA 水平即能
15、引起 HCV 感染11。四多种理化因素对肝细胞超微结构的影响 现代社会中环境污染日趋严重，各种微波、次声波和有害气体充释在我们身边，因此，研究微波辐射、次声波、二氧化硫等对肝细胞的影响对公民健康具有重要意义，下面本文将在这方面进行概述。（1）林蛙油营养液对微波辐射的保护作用林蛙油是地道的东北特产, 含有多种氨基酸、无机元素、维生素和多种复合多肽等生物活性因子, 可以提高机体免疫力功能和抗应激能力, 并能明显提高巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数, 清除自由基, 增强机体非特异性免疫功能和体液免疫功能。己糖激酶广泛存在于以糖为能源的肝细胞内, 是单糖氧化成能量被人体吸收利用的第一个关键酶,当肝脏受到损伤
16、时, 该酶随之下降。从实验中可以看出, C 组损伤最为严重, 超微结构变化主要表现在肝窦明显出血, 肝内脂肪滴较多, 可见髓样小体; 血清中 C 组己糖激酶活性也明显低于空白对照组( A 组) 和林蛙油营养液+ 超重+辐射+ 林蛙油营养液组( F 组) , 超微结构变化与酶的变化基本一致。给予林蛙油营养液可使肝组织损害有所改善, 但与损害因素前和损害因素后给予无明显关系( 超微结构和酶的变化,D 组与 E 组均相差不大) 。F 组线粒体多、粗面内质网丰富, 特别是糖原颗粒增多, 同时 F 组的己糖激酶水平已达到空白对照组水平, 说明肝细胞修复活跃和良好。由于 F 组是在损伤因素干预的前后均使用
17、林蛙油营养液合计 28 天, 除了表明林蛙油营养液对超重状态下微波辐射有保护作用, 还可以推论林蛙油营养液使用时间越长对肝脏的保护作用越大。实验说明, 使用林蛙油营养液对微波损伤有一定保护作用, 特别表现粗面内质网丰富和糖原颗粒增多, 提示林蛙油营养液对损伤细胞有较好的修复作用; 超微结构的变化与血清中抗酒石酸酸性磷酸酶和己糖激酶活性基本一致。由于干预时间较短, 对其远期效果尚有待进一步研究12。（2）次声 90 dB 和 130 dB 致大鼠肝细胞损伤此实验观察了 16 Hz, 130 dB 和 90 dB 次声作用大鼠不同时间后肝细胞超微结构的变化, 发现次声作用肝细胞超微结构的损伤, 作
18、用具有广泛性, 不存在明显的结构选择性. 其损伤既涉及到肝细胞的核、质、膜的损伤, 造成 Disse 间隙的改变, 又影响到血窦内皮细胞膜和胆小管轮廓的损伤。 在此实验条件下, 在次声作用 21 d 内, 肝细胞超微结构损伤程度随时间的延长而加重, 次声作用 28 d 时, 其损伤程度较前有所减轻, 提示次声作用引起的肝细胞损伤可能有一定时限性, 提示了肝脏组织亦对次声作用具有一定适应性, 另有一些实验也观察到了组织对次声的适应现象。其适应机制有待研究.实验结果表明, 在本实验条件下, 次声对大鼠肝细胞多次作用的损伤是直接的、广泛的、无组织结构的特异性; 次声对大鼠肝细胞超微结构损伤以变性为主
19、, 并随作用日数的增多而可以出现部分坏死; 在相同的频率和声压水平不同情况下, 会因作用日数增加而有差异, 声压水平大( 130 dB) 损伤作用大 , 声压水平小 ( 90 dB) 损伤作用也小. 肝脏组织对次声作用具有一定适应现象13。（3) 二氧化硫吸入对小鼠肝脏超微结构的影响肝是机体重要的器官之一，具有代谢、合成、分泌和解毒等多种功能。本次实验发现，SO2 吸入造成肝细胞的多种损伤，具有一定的剂量依赖性。肝细胞线粒体对 SO2 的毒性作用也非常敏感。SO2 28 mg/m3 染毒组小鼠，肝细胞表现出轻度肿胀。可见线粒体肿胀，基质密度降低，嵴变短或消失，核周隙不规则增宽，粗面内质网轻度扩
20、张，胞质内有大小不等的脂滴出现。SO2 56 mg/m3 染毒组小鼠，肝细胞发生轻度肿胀及变性。肿胀的肝细胞可见线粒体肿胀，有的变形形成髓鞘样结构，有些细胞中还有巨线粒体出现，粗面内质网扩张，部分脱颗粒，胞质内 SO2 112 mg/m3 组型肺泡上皮细胞微绒毛明显减少，板层体空泡化，线粒体致密化，染色质凝聚 正常组肝脏超微结构，细胞核染色质疏松，粗面内质网呈捆状密集排列和线粒体丰富且结构完整呈椭圆。SO2 56 mg/m3 组小鼠肝细胞线粒体肿胀，嵴变短或消失，粗面内质网扩张，部分脱颗粒分散有大小不等的脂滴；变性肝细胞体积缩小，核皱缩，染色质凝聚，有的表现出核膜不清或完全消失，细胞器明显减少
21、等坏死性病理改变；另外，在肝细胞间还可见到淋巴细胞。SO2 112 mg/m3 染毒组小鼠，肝细胞发生肿胀、嗜酸性变及脂肪变。肿胀的肝细胞表现与 56mg/m3 SO2 染毒组相似；脂肪变肝细胞中充满大小不等、电子密度中等的均质性脂滴和数量明显增多的次级溶酶体，核间隙不规则增宽；嗜酸性变肝细胞体积缩小，核皱缩，线粒体明显增多、肿胀；另外还可见到明显的核碎裂坏死的肝细胞，有的伴随有线粒体膜消失，细胞器消失等坏死性病理改变。此外，还可见到有的肝细胞窦面微绒毛肿胀并形成大空泡，突入甚至脱落于窦周隙，造成胞质丢失；并可见胶原原纤维出现，肝脏内皮细胞的窗孔明显减少等病变。SO2 吸入造成肝细胞的多种损伤
22、，肝细胞线粒体对 SO2 的毒性作用也非常敏感。另外，核以及粗面内质网的病变也很明显，而粗面内质网的扩张常伴有核糖体的脱落，结果可导致脂蛋白合成障碍，内质网合成的甘油三酯贮积增加，从而引起肝细胞中脂质大量沉积，发生脂肪变性，进一步发展则引起肝细胞的坏死。另外，在肝细胞间还可见到淋巴细胞，这可能也是引起肝细胞坏死的一个重要原因14。小 结尽管电镜技术用于临床疾病的研究和诊断还有很多局限性, 但其具有特殊的优势。目前, 电镜的应用已远远超出了形态学范围, 而与生物化学、计算机生物学等学科发生了内在联系, 并已成为生物学、临床医学、农林科学等研究领域必不可少的试验手段。因此, 开展电镜诊断学, 就要
23、求电镜观察者既要有电镜技术的综合运用能力, 又要熟悉各组织的超微结构及超微结构病理变化, 同时还必须有丰富的普通病理诊断经验, 这样才能对临床疑难疾病或容易混淆疾病的诊断提出诊断标准和鉴别诊断标准。我们有理由相信, 随着电子显微镜性能的不断提高和各种相关新技术的应用, 电子显微技术将在临床疾病的研究和诊断中扮演越来越重要的角色。参考文献1 张玉喜,马晓瑞 ,马国仁. Gilbert 综合征 21 例临床分析J. 宁夏医学杂志, 2010, 32(7):634-6352 彭向欣,王泰龄.16 例 Gilbert 综合征患者的临床、病理特征和基因分析J. 中华肝脏病杂志, 2008,16(5):
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