1、家兔关节软骨细胞的分离与培养实验动物 3 周龄新西兰大白兔实验试剂 胎牛血清 , 胰蛋白酶 , II 型胶原酶, 台盼蓝 , DMEM 培养基, 甲苯胺蓝染色剂主要试剂配制方法1.0.01mol/L PH7.2 一 7.4PBSNaCI 8.0 克KCI 0.2 克KH2PO3 0.2 克Na2HPO312H2O 2.08 克精确称量上述药品并充分溶解于 1000mL 三蒸水中，用 1mol/L HCI 和 1mol/L NaOH 溶液调整 pH 值至 7.2 一 7.4。2.DMEM 培养液将 DMEM 干粉一包溶于 1O00mL 三蒸水中，按说明书加入 NaHCO3，并加入双抗(终浓度为:
2、青霉素 100U/mL，链霉素 100U/mL)和维生素 C(终浓度为:50mg/L)，调节 PH 到 7.0 一 7.2，超净工作台内过滤除菌。置一 200C 冰箱保存备用。如需含血清的培养基，于使用前加入足量 56水浴灭活 30 分钟的胎牛血清(FCS)。.1.3 主要实验仪器倒置显微镜, 数码照相机, 二氧化碳培养箱(2300 型),超净工作台(SW-CJ 一 IF 型),低温离心机(Megafuge1.oR 型),电子天平(MAllo 型)磁力搅拌器.2 方法.2.1 兔关节软骨细胞的培养与传代将一只健康的三周龄新西兰大白兔耳缘静脉空气栓塞处死，备皮，用碘酒消毒背部及四肢皮肤，在无菌操
3、作下，在超净工作台内用手术刀削下双侧膝关节软骨，以不渗血为度。充分漂洗软骨小块。用眼科剪将软骨组织剪成约 lmm3小的碎块，收集置于离心管中，以 PBS 冲洗 2 次，向离心管加 10 一巧 mLO.%胰酶。吹打成组织悬液，装入 50mL 玻璃培养瓶。放进二氧化碳培养消化 1 时。消化后将培养瓶静置桌上，待软骨组织沉淀后，吸出胰蛋白酶。将配好 0.10kH型胶原酶 10mL 以滤器过滤入培养瓶，加入 0.stnL 胎牛血清。放进二化碳培养箱消化 4 一 6 小时。细胞从基质中释放于消化液中，经过滤除去未被消化的软骨碎片，将消化液置于离心管中 100orpm、10min 离心，弃上清液收集软骨细
4、胞，加 DMEM 液，1000 印 m、10 而 n 离心，冲洗 2 次，弃上清液，加入上述细胞培养液(含 10%FBS 的青霉素、链霉素的 DMEM 培养液)制成细胞悬液，滤网过滤，血球计数板计数，并把细胞悬液稀释成 2x105/c 时的密度，接种于 25c 衬的培养瓶中，血球记数板计数。以台盼蓝染色法检查死亡细胞比例，死亡细胞比例约 10%左右。把培养瓶置于二氧化碳培养箱中进行软骨细胞原代培养(温度 37，饱和湿度，50k 二氧化碳，950k 空气)。每日在倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况，72 小时后视细胞贴壁情况更换培养液，以后每两天更换培养液一次。待软骨细胞铺满瓶底后，进行传代培养。
5、 细胞生长增殖形成单层细胞后，镜下观察软骨细胞聚集成片，待约 80%的细胞汇合，即进行细胞传代。吸除培养液，PBS 清洗后，加入 0.25%的胰蛋白酶ZmL，室温下静置消化 5 一 10 分钟，倒置显微镜下观察细胞质回缩，细胞重新变成圆形，细胞间隙增加，少量细胞开始浮游，此时迅速而轻柔地倾去胰蛋白酶溶液(不使瓶底细胞随胰蛋白溶液流失)。以 PBS 液轻洗一遍后加入新培养液。然后吹打细胞使其散开重新成细胞悬液，按前述方法分瓶培养。每日在倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况并拍照，2 一 3 天换液 1 次，待软骨细胞铺满瓶底后，再次进行传代。1.1.2.2 软骨细胞的形态学观察以及组织化学染色鉴定1
6、.1.2.2.1 镜下观察软骨细胞并制作细胞爬片每日在倒置显微镜下观察软骨细胞形态、生长情况，照相。将传一代细胞按2x105/c 时的密度接种到铺有多聚赖氨酸盖玻片的 6 孔细胞培养板中，培养条件与原代培养相同，制作细胞爬片。1.1.2.2.2Gicmsa 染色光镜观察细胞 70%融合时取出细胞爬片，放在冰醋酸与甲醇之比为 1:3 的固定液中固定 10 分钟。晾干用 Giemsa 染液( 将 oiemsa 原液用 pH6.8 的 PBsl:10 稀释)染色15 分钟。晾干后用二甲苯、透明树脂封片。倒置显微镜下观察，并行细胞照相。1.1.2.2.3 甲苯胺蓝染色鉴定细胞表型细胞在盖玻片上长满后取
7、出细胞爬片，PBS 漂洗二次，70%乙醇固定 20 分钟以除去四价铵离子，以免影响染色，再用 PBS 漂洗二次后，吹干。加入甲苯胺蓝乙醇液(甲苯胺蓝 0.29 溶于 30%乙醇 IO0ml 中配制而成 )染色 10 分钟，用蒸馏水冲洗，倒置显微镜下观察并照相。因软骨细胞分泌的蛋白多糖能被甲苯胺蓝异染，呈红色、紫红色，据此可鉴定软骨细胞的表型。讨论1.3.1 软骨细胞的原代培养方法过去曾经广泛认为软骨细胞不具备分裂增殖的能力，故长久以来未能开展其体外培养研究。1967 年，ManningandBonner 用胰蛋白酶和胶原酶联合消化关节软骨，从坚韧的软骨基质中分离出来软骨细胞，获得数量充足且纯度
8、比较高的软骨细胞接种于培养液中进行体外培养，并发现其具备分裂增殖的能力，从此开创了软骨细胞的体外培养技术，为研究 OA 提供了新的方法。因为成年动物关节内可用于分离培养细胞的软骨总量较幼年动物少，而且成年动物的关节软骨组织容易存在损伤，在此基础上获得的关节软骨细胞本身的增殖、合成、分化功能就比幼年来源的软骨细胞差20，所以本实验采用 3 周龄的新西兰幼兔获取软骨细胞。关节软骨由软骨细胞和细胞外基质组成，建立良好的机械和化学解离方法，通过原代培养和传代培养，可分离培养出较高纯度的软骨细胞 12 。机械分离时，需注意除干净软骨表面的滑膜组织。不能误带软骨以外的组织，尽可能把软骨切碎至于 lm 角
9、3 大小。软骨细胞的化学解离主要是用酶法解离，有联合酶消化法，单酶消化法等【2。本实验采用胰蛋白酶和胶原酶 H 联合消化法。取材中消化的时间至关重要，时间太短，软骨细胞不能充分游离，影响软骨细胞的收获量，不于培养。胶原酶接触时间过长对软骨细胞有毒性作用，死亡的细胞机会增多，样不利于培养 lz2。作者的经验是，先采用胰蛋白酶消化 1 小时，离心清洗后再以胶原酶 H 消化 4 一 6 小时，镜下观察到细胞充分游离悬浮呈大团鱼子状即可加入牛血清终止消化收集细胞。软骨细胞属于低氧、低代谢细胞，它适合在PH 值 7.2-7.4 的培养液，10%胎牛血清，5%CO:中生长，胎牛血清对细胞的生存增殖是可缺少
10、的，维生素 C 是软骨细胞合成胶原必需的原料，对软骨细胞保持还原性着重要的作用。原代细胞贴壁较慢，一般需要 24 一 36 小时，其分裂增殖的速度较慢，而传代后贴壁和增殖的速度都大为增加，一般在 12 小时左右。这可能原代细胞在消化分离时受到一定的机械或化学性的损害有关。软骨细胞的接种度若过低，因为软骨细胞依靠自分泌或旁分泌的信号而存活，软骨细胞只有接邻近软骨细胞释放的活性因子才能维持生理功能，故细胞易与基质间失去联，细胞因子无法提供反馈调节，细胞出现去分化，呈成纤维细胞样，合成H 型原的能力下降。合理的培养密度，有助于自分泌因子维持其表型和基质的新代谢，阻止或减缓细胞的去分化23，2 。但过
11、高密度的接种也会引起接触抑制导软骨细胞死亡。所以在培养时，要注意细胞接种的密度。软骨细胞的接种密度 2xl 护/c 时为宜。.3.2 软骨细胞的表型鉴定以及实验用软骨细胞的选择11 型胶原纤维是关节软骨的主要组成成分，软骨细胞能特异性地合成 11 型胶纤维。它们相互交织为网状的微纤维形式，使得胶原纤维之间有较大的空隙可容纳硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitinsulfateprotcoglycancSPG)分子和结水分子，既起到关节软骨组织的支架作用又保证软骨组织富有弹性，能适应抗和耐磨需求。胚胎期胶原纤维由 I 型转为 11 型，显然是遵循着形态和机能相统的原则随软骨细胞逐渐分化成熟而实
12、现的。除了胶原纤维，软骨基质中另一重组分是蛋白多糖，它们填充在由胶原纤维构成的支架中，是软骨发挥正常生理能的物质基础25 。在正常情况下，软骨细胞合成并调节其胞外基质中的结构成分，使它们在合成与降解之间维持动态的平衡26。软骨细胞可以特异性产生 H 型胶原及 CSPG，只有软骨细胞和视网膜神经细胞才具备合成 11 型胶原的能力，其它细胞和组织则不能。甲苯胺蓝能使 CSPG 中的硫酸软骨素异染成紫红色，故 11 型胶原免疫组化染色或甲苯胺蓝染色阳性，结合细胞的外形特征和取材部位，均可作为对软骨细胞进行鉴定的手段27l。本研究采用甲苯胺蓝染色的方法，证实所培养的细胞是纯化的软骨细胞，并保持了体内软
13、骨细胞的基本特性和表型。软骨细胞在体外培养过程中有两种转归:一是继续维持表型(PhenotyPe)，具有分泌 11 型胶原蛋白和 csPG 的能力，二是发生去分化(Dediffereniiation)I28。软骨细胞在体外培养过程中 fl 型胶原和蛋白多糖表达降低而失去其生物学特性的现象被称为“去分化”z9 一 30，细胞不仅形态发生改变，由多角形、椭圆形逐渐变为梭形，而且所分泌的胶原蛋白不再是 11 型而成为 I 型，CSPG 的合成能力也随之丧失。3 代以内的培养软骨细胞相对稳定，以圆形、类上皮细胞样外形为主，细胞分泌基质形成群体后，变成梭形或多角形，但组织化学染色证实其分泌硫酸软骨素，故
14、也是软骨细胞，3 代以内的软骨细胞活性高，保持细胞的表型，是实验研究的理想细胞。3 代以后的细胞逐渐发生去分化，细胞体积增大，出现许多指状突起，胞核增大，细胞增殖速度明显减慢，分泌基质的能力下降。逐渐丧失其表型特征。但可作为软骨细胞退行性变的研究模型。有研究者认为在 5 代以内软骨细胞表型可保持稳定22l，能用于试验研究，这可能与试验动物的年龄、接种的密度以及培养的条件相关。国外有研究通过测定 H 型胶原和蛋白多糖的变化，认为传代对细胞表型影响很大，即使在体外的三维培养中也不例外3。所以研究药物的最佳反应和组织工程最好选用 3 代以内的软骨细胞。如何使软骨细胞在体外扩增过程中保持其表型，从而获得足够数量有功能的软骨细胞尚待作进一步的研究。小结兔软骨细胞的分离与培养采用机械解离和化学解离法，化学解离法可采用胰蛋白酶和胶原酶 11 联合消化法，原代培养应选用适当的接种密度。软骨细胞表型以甲苯胺蓝染色技术进行鉴定。进行软骨细胞的实验用 3 代以内培养的软骨细胞比较理想。
