1、微生物菌种保藏管理中心操作指南保藏方法冷冻干燥法、-80冻结法、 液氮超低温冻结法。冷冻干燥保藏法将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。操作步骤如下：好氧菌冷冻干燥管的制备1 安瓿管准备安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用 2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至 pH 中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121下高压灭菌 15-20 分钟，备用。2 保护剂的选择和准备保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及 pH 值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除
2、上层油脂，一般在100间歇煮沸 2-3 次，每次 10-30 分钟，备用。3 冻干样品的准备在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件微生物菌种纯度检测技术规程（试行），与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于 108-1010 个/ml 为宜（以大肠杆菌为例，为了取得每毫升 1010 个活细胞菌液 2 毫升-2.5 毫升，只需 10 毫升琼脂斜面两支）。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约 0.1-0.2 毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心
3、去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在 1-2 小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。4 预冻一般预冻 2 小时以上，温度达到-20到-35 左右。5 冷冻干燥采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为 8-20小时。6 真空封口及真空检验将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。7 保藏安瓿管应低温避光保藏。8 质量检查冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形
4、态变异、杂菌污染等。厌氧菌冷冻干燥管的制备主要程序与需氧菌操作相同，注意保护剂的选择和准备，保护剂使用前应在 100的沸水中煮沸 15 分钟左右，脱气后放入冷水中急冷，除掉保护剂中的溶解氧。复苏方法 先用 70%酒精棉花擦拭安瓿上部， 将安瓿管顶部烧热， 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端， 用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。-80低温冷冻保藏法将菌种保藏在-80冰箱中以减缓细胞的生理活动进行冷冻的一种保藏方法。操作步骤如下：1 安瓿管的准备安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用 2%盐酸浸
5、泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至 pH 中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121下高压灭菌 15-20 分钟，备用。2 保护剂的选择和准备保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及 pH 值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100间歇煮沸 2-3 次，每次 10-30 分钟，备用。3 微生物保藏物的准备在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件微生物菌种纯度检测技术规程（试行），与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少
6、于 108-1010 个/ml 为宜（以大肠杆菌为例，为了取得每毫升 1010 个活细胞菌液 2 毫升-2.5 毫升，只需 10 毫升琼脂斜面两支）。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约 0.1-0.2 毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在 1-2 小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。4 冻结保藏将安瓿管或塑料冻存管置于-80冰箱中保藏。5 复苏方法从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置 38-40水浴中快速复苏并适当快速
7、摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需 50 秒-100 秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。液氮超低温保藏法液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196的液态氮，或在-150 的氮气中的长期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。操作步骤如下：1 安瓿管或冻存管的准备用圆底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料冻存管。注意玻璃管不能有裂纹。将冻存管或安瓿管清洗干净， 121下高压灭菌 15-20 分钟，备用。2 保护剂的准备保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度，一般采用 10-20%甘油。3 微生物保藏物的准备
8、微生物不同的生理状态对存活率有影响，一般使用静止期或成熟期培养物。分装时注意应在无菌条件下操作。菌种的准备可采用下列几种方法：刮取培养物斜面上的孢子或菌体，与保护剂混匀后加入冻存管内；接种液体培养基，振荡培养后取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内；将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块（直径约 5-10 毫米），真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护剂混匀后加入冻存管内；在小安瓿管中装 1.2-2 毫升的琼脂培养基，接种菌种，培养 2-10 天后，加入保护剂，待保藏。4 预冻预冻时一般冷冻速度控制在以每分钟下降 1为好、使样品冻结到-35。目前常用的有三种控温方法：
9、 程序控温降温法，应用电子计算机程序控制降温装置，可以稳定连续降温，能很好地控制降温速率。 分段降温法：将菌体在不同温级的冰箱或液氮罐口分段降温冷却，或悬挂于冰的气雾中逐渐降温。一般采用二步控温，将安瓿管或塑料小管，先放-20至-40 冰箱中 1-2 小时，然后取出放入液氮罐中快速冷冻。这样冷冻速率大约每分钟下降 1-1.5。 对耐低温的微生物、可以直接放入气相或液相氮中。5 保藏将安瓿管或塑料冻存管置于液氮罐中保藏。一般气相中温度为-150，液相中温度为-196。6 复苏方法从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在 38-40水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需 50 秒-100 秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。
