1、血红蛋白的提取和分离,一、基础知识,（一）凝胶色谱法：（也叫分配色谱法） 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。 原理：所用凝胶实际上是一些微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构成的。在小球体内部有许多通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,凝胶色谱法分离蛋白质的原理,（二）缓冲溶液,具有缓冲作用的溶液称缓冲溶液。缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PH的影响，维持PH基本不变。一
2、般由缓冲物质对构成，如： H2CO3 / NaHCO3 、NaH2PO4 / NaHPO4 作用机制：以H2CO3 / NaHCO3 为例 A：当酸性物质（如乳酸）进入后，与溶液中的 NaHCO3 发生作用，生成乳酸钠和碳酸，而碳酸可以分解成CO2和H2O，CO2排出则PH不变；B：当碱性物质（如碳酸钠）进入后，与溶液中的H2CO3 发生作用，形成 NaHCO3 ，溶液PH不变。,（三）电泳,1、定义：是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 2、原理：许多大分子都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动；不同分
3、子带电有差异，分子本身的大小、形状不同，在电场中产生不同的迁移速度，从而可实现样品中各种分子的分离。,凝胶电泳原理示意图,（四）血红蛋白,在红细胞的组成中，约90%是血红蛋白。它由四个肽链组成，包括两个肽链和两个肽链。每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含血红素而呈现红色。,二、实验操作,蛋白质的提取和分离一般分为四步： （1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。 （2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。 （3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。 （4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。,（一）样品处理
4、,1、红细胞的洗涤： 目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。 2、血红蛋白的释放： 在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放 3、分离血红蛋白溶液： 离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。 4、透析： 装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。,红细胞的洗涤,分离血红蛋白溶液,有机溶剂 无色透明的甲苯层,脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层,血红蛋白溶液 红色透明液体,红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物,练习巩固,1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是 A 弄清各种蛋白质的
5、空间结构 B 弄清各种蛋白质的功能 C 弄清各种蛋白质的合成过程 D 获得高纯度的蛋白质,2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是 A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质 B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质 C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质 D 二者根本无法比较,3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异 4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是 A 调节pH B 维持红细胞的能量供应 C 防止微生物生长 D 防止血液凝固,5、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数和CO2分子数分别是 A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、1 6、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是： 有机溶剂-脂类物质-血红蛋白溶液-红细胞破碎物沉淀,
