1、 1细胞遗传学课程论文年级专业：10 级农学 1 班论文作者：杨倩学 号： 老 师：何凤发2染色体分带技术及其应用杨倩2010 级农学一班摘要:染色体分带是 60 年代后期发展起来的一项细胞学技术,借助于某些物理、化学处理使中期染色体显现出深浅不同的带纹，各物种的每一条染色体其带型纹的数目、位置、宽度及深浅度都有相对的恒定性，因此染色体分带是染色体识别的重要依据。这一技术自发展起来便广泛应用，已成为鉴别基因组中的各个染色体或较大的染色体片段、追踪外源染色体的有效手段。关键词：染色体分带；遗传学；应用Chromosome banding technique and its application
2、Yang Qian Class one of AgricultureAbstract：Chromosome banding is a cytological technique，development of 60 time later period rises , with the help of some physical, chemical treatment to metaphase chromosomes showed different bands, each species of every chromosome the band profile number, position,
3、 width and depth are relatively constant, so the chromosome banding it is the important basis for chromosome identification. This technique is widely used since the developed，it has become the differential genome in various chromosome or larger chromosome fragments, tracking of exogenous chromosomes
4、 effective means。Keyword：Chromosome banding；genetics；application3引言染色体分带技术是一种用染料对染色体进行分化染色的方法。用一般细胞学染色法，染色体着色是均匀的，但若经过某些物理化学等条件如: 温度、酸碱等处理后再以染料染色， 或单经某些荧光染料染色就可以染出深浅不同的带纹的纵向结构。由于这些带纹和结构是染色体固有结构的反映, 因而各不同物种之间、同一物种各( 染色体之间同一染色体处在细胞不同分裂时相) 之间所出现的带纹也就不同。这就不仅使我们鉴别染色体组中各个染色体及其大的片段提供了极大的方便, 使追踪某一特定染色体在遗传或杂
5、交中的去向成为可能, 同时也为进一步认识染色体本身的结构和功能提供了一种有利的分析手段。因而有人认为分带技术为核型研究带来了一次革命，看来也并不过分。第一个对染色体作分化染色的是Heitz ,他在1928年报道了苔鲜植物染色体以碱性染料着色后呈现深浅不同的分节构造。之后又有人用各种化学或物理方法处理。染色后使染色体呈现各式花纹, 并曾以此作为研究动、植物核型及对性染色体的识别，但当时由于人们对染色体的结构了解很少, 对其中D N A 和染色体蛋白毫无知识, 因此Heitz 当时的报告未被重视。1968年Caspersson 等人开创了用氮芥哇叮咙(Quinaerine Mustard ， Q
6、M， 一种荧光染料 )在蚕豆、延令草属等植物细胞和中国田鼠的细胞的染色体上染得亮、暗相间清晰的荧光分带。1 9 7 0 年又成功地获得人染色体荧光分带带纹即Q 带。同年在原位杂交检测 D N A 高度重复顺序的工作中 , 发现在细胞学水平上D N A 变性、接着在复性之后, 以Giemsa 染色, 能使重复顺序D N A 相应节段上深染, 这就是 C 带。 1 9 7 1 年发展了一种以碱和盐处理后, 再染以Giemsa，可以使人类各条染色体出现特有带纹，即G 带。这些分带技术首先在人类染色体上发展起来，成功地确定了标准的人类核型。在临床应用上, 描述了某些特定染色体带纹的改变所产生的综合征。
7、然后又扩大到哺乳动物到其他动物, 再到植物。但在植物上应用的成就不及动物方面显著。在我国, 动物染色体分带工作也在70 年代开始, 以核型分析为主, 临床上、则以染色体异常疾患为主。目前人类染色体分带在不少医院中正成为常规化验项目之一。植物方面也有不少文章, 但以建立方法为主。1 染色体分带简述1.1 染色体分带的带纹种类1.1.1 Q 带瑞典细胞化学家 T . Caspersson 等用荧光染料芥子喹吖因作染色剂处理, 染色体制片在荧光显微镜下观察，染色体呈现明暗相间的清晰带纹。不久，C.G.Vosa 发现用与芥子喹吖因类似的喹吖因处理也能使植物染色体显带.由这两种染料处理产生的带称为 Q
8、带。1.1.2 G 带G 带是动物细胞遗传学研究中常用的技术。它是用碱 盐溶液对染色体制片进行4预处理，有时也用胰蛋白本酶或链霉蛋白酶进行处理，然后用 Giemsa 染料染色。一般认为 G 带显示的是常染色质构成的染色粒，它所反映的很可能是蛋白质尤其是组蛋白在染色体上的不均一分布。 1.1. 带 带是用酸、碱对染色体标本进行变性处理，然后置于溶液中，在 下保温不等，再以 Giemsa 染料染色。由于起初在哺乳动物中发现带纹位于着丝粒区域，故称之为着丝粒带，简称带。带技术对辨认染色体是非常有用的。带已广泛应用于植物材料的研究，如利用带能识别小麦的对染色体。1.1. 带带等为显示 NOR 建立的方
9、法。带是用三氯醋酸和盐酸先后处理，Giemsa 染料染色后获得。 带并非专一地显示核仁组织区，在次缢痕、随体、着丝粒、端粒及臂间的异染色质区域均能显带。带技术方法简便，结果稳定，在植物染色体研究中得到较广泛的应用。1.2 染色体分带技术的命名由于染色体分带技术是分化染色技术,所以习惯上常按所使用的染料或染出的结构来命名。近五年来随着分带技术应用的逐渐普及和采用的染料逐渐增多, 分带名称也日益增多。有些工作者曾试图以染色体的固有结构把分带技术划分为儿大类, 但由于分带机理目前尚未有定论, 这种分类方法也未趋统一。这里仍按习惯以所使用的染料归类, 如下:1.2.1 荧光染料以荧光染料处理染色体后,
10、 在荧光显微镜下, 可见深浅不同的带纹, 按染料常见的有以下几种:Q 带: 以荧光染料Quinaerine 染色, 故名。所染标本在荧光显微镜下 , 经紫外光照射后显示出强度不同的淡黄色荧光, 可以区分出亮带Q +和暗带 Q-。Q 带十分恒定, 因此目前已前利用电子计算机来作核型分析,能检出微小的畸变。H 带: 以Hoeehest 3 3 2 5 8 染出的带纹。相似于Q 带。A O 带: 若在染色前先经 BrdU 溶液处理, 再以磷酸缓冲液浸泡一定时间, 然后结合叮吮橙染色, 在动物细胞染色体上呈现出黄色的类似R 带的带纹。5此外, 还有以 D A PI染色的D A PI 带, 也是显示对应
11、于不同异染色质部分。荧光染料分带的优点是材料处理比较简单, 重复性好。虽易退色但可重染。缺点是所制标本不能保存, 月需要荧光显微镜等特殊设备。1.2.2 Giemsa染料常规制成的染色体标本, 经温度或不问浓度的酸、碱、盐、尿素、酶等试剂处理后, 再以 Giemsa染液染色, 便可使染色体呈现不同的带纹, 主要有 :C 带: 染色体标本经一定浓度的N a O H或B a( 0 H )2处理后 , 然后在缓冲盐溶液中热水解, 再以Giemsa染液染色。经此法处理后所染出的结构, 在哺乳动物主要在着丝点或着丝点附近的次绕痕及人的Y 染色体长臂远端1 / 2 处出现深染区。在植物中C 带也分布在次隘
12、痕、随体、着丝点基部和染色体两端部及中间部位。C 带显示的主要是结构异染色质, 因此C 带深染部分不仅在中期染色体, 也可在间期核中看到。F一B S G 法: 植物细胞染色体经火焰干燥等一系列处理后 , 再进行B S G 法处理。国内应用此法已在65 种农作物上显示C 带带纹G 带 : 若在染色前的处理较C 带技术温和些, 则在动物染色体上所显示出带纹较C 带带纹丰富, 称为G 带。如染色标本经胰酶或S D S 处理染色后显示 G 带, 经照相后标本入50 % 醋酸数秒钟退色后, 再经碱和热盐水解 , 染色后即得C 带。同样染色体标本在尿素液内温育数秒钟后染色获G 带, 若延长至2 小时即显C
13、 带。在不同时间处理的标本中可见G 带逐渐破坏的图象。动物中G 带只见于中期分裂相的染色体, 其带纹与Q带相似, 但并不完全一致。一般认为G带深染部分代表异染色质区域。在植物中往往不能染出典型的 G带。R 带: 即反带 (Reversebandiog ) , 若将G 带技术染色前处理稍加改变, 则染色后所呈现6的带纹恰好与Q 带和G 带相反。在 Q带和G带中的显带区, R 带中则为浅色区, 故名反带。它可以弥补Q 带和G 带, 有助于确定两臂末端上结构的变化。在R 带中深染部分代表染色体中活动的常染色质区。N 带: 染色体标本经一种特殊的与C 带技术相似的强烈方法 , 例如三氯醋酸, D Na
14、se等处理后, 可使核仁组织者区深染。此法重复性好, 在植物中使用较多。C d 带 : 经盐水加热处理后, 经Giemsa 染色, 在着丝点区域呈现两个大小相等的小点 , 可能是代表与纺锤丝相联结的小球。1.2.3 其它染料银染: 一般用氨银法处理染色体, 可以使有转录活性的核仁组织者区域(N O R ) 着色, 此法应用颇广。H y 带: 染色体经热的盐酸处理后, 以醋酸洋红染色, 在植物中可以相当快地产生一种特殊的H y+和H y带纹。可能是染色体蛋白被分化性的抽提。O 带：染色体标本温育在含有地衣红的SSC溶液中能获得与G 带相似的O 带。F 带: 经孚尔根染色法产生的带纹称F带。人的Y
15、 染色体长臂远端一半区域 Q和G 带为负反应, F 带则为正反应。有人发现孚尔根分带法可以在间期和中期区分结构异染色质和富A T 和G C 的类型。这是Giemsa 染色植物体所做不到的。1.2.4 免疫化学染色法各种核苷或核苷酸与载体蛋白的结合物免疫家兔后获得相对应的抗体。一种是直接标记荧光于抗体上, 与变性的染色体D NA染色后即可在荧光镜下观察。另一种是采用简接荧光法和间接免疫酶标法，即以上述对应抗体作为第一抗体与变性染色体的D N A 作用后, 再以荧光标记或过氧化物酶标记的羊抗免,球蛋白为第二抗体染色后, 前者即在荧光镜下呈7现出各种核苷或核苷酸抗体的Q 带、R 带、C 带, 后者需
16、再经 D A B 在H 2O2 存在下显示棕色分带着色。不同核苷酸抗体需要不同的染色体D N A 变性处理, 一般采用光氧化或U V 变性此法对分析染色体结构和功能是一种新的手段。2 几种染色体分带技术的应用2.1 染色体的荧光组织化学染色体的荧光组织化学近年发展很快, 其中一个重要方面就是多种荧光染料的联合使用。通常首先使用和O N A 相结合的荧光染料, 然后以另一种荧光或非荧光染料复染。组合使用的优点是1. 选用适当的组合, 当单一染料显示的带纹不够清晰时, 以另一种染料复染常可带纹或多态区更为清晰, 反差更为强烈；2 一些组合可以显示特定的染色体多态区, 如强荧光的异染色质区(DA/D
17、API染色)。看来荧光染料的联合使用对于染色体精细带纹的显示, 染色体多态性、染色体重组的研究都是非常有用的(表1 )。表1 荧光染料的联合使用类型 初染 复染 显示的带纹G一C / A一T 色霉素A 3 甲基绿 R 带G一C / A一T 色霉素A 3 纺睡菌素 R 带A一T / G一C Hoechst33258 放线菌素D QFHA一T / G一C 阿的平 放线菌素D 或 QFQ7 一氨基放线菌素 DA一T /A一T Hoechst33258 纺锤菌素 DADAPI利用这种染料组合的方法, Schnede 等(1981) 以色霉素 A3 /远霉素A和DAPI(DA一8DAPI ) 染色, 证
18、明猪染色体上分布有两类不同的异染色质。双臂染色体(Nos. l一12 )和X 染色体的异染色质富于GC。以色霉素A 3 染色显示亮荧光。端着丝点染色体(N os.13 一18 ) 的异染色质区可为DA一DAPI 所显示。也可为另一种新的荧光染料D 287 / 170 所染色, 发亮光。虽然DA一DAPI 和D 287/170染色的机制尚未得知, 但至少说明, 猪的染色体组里有两类不同的结构异染色质。一种分布于双臂染色体, 另一种分布于端着丝点染色体。这对于了解家猪的起源, 异染色质的分化, 罗伯逊易位的意义等是有帮助的。2.2 高分辨率G带大家知道, 通常哺乳动物细胞停留在前期的时间很短, 只
19、有2一3 分钟。但是PCC 方法的发明已使可能得到纤细的带状G 2或G 1染色体。两者都可作G 分带染色。其长度比中期染色体长4 倍以上( 表2) 。带纹也更为丰富。中期染色体含3 个横带的区域在G 2染色体可呈现6 个带。表2 黑田鼠(Mie r o tu s a g r e st is) X 染色体G Z期和中期长度的比较时相 测量的染色体数 平均长度(M) 相对长度早G 2 3 48.0 4.2中G 2 13 39.6 3.5后G 2 4 16.4 1.5中期 20 11.3 1.0人工多线化的第二个可能途径是内复制。有关人工诱发内复制的研究已给这方面投下了希望的曙光。Sutou等(19
20、74)以4 NQO , Captan , 环磷酞胺, 叮吮橙等处理离体的中国仓鼠细胞, 观察到内复制率明显增高。Kusyk等(1979)以Hoechst33258 ,rubidazone 两者连合使用, 可使小鼠L细胞和 CHO细胞的内复制率高达 20一50% , 最高可达7 % 。可以9期待, 随着人功内复制和PCC技术的进一步改进, 有朝一日我们将会得到哺乳动物的多线染色体, 使G 带技术进入一个完全崭新的时代。3 染色体分带技术的前景展望随着染色体分带技术越来越成熟，我相信在以后的研究中，人们会利用染色体分带技术对动、植物的染色体进行更深入的探索。相信染色体分带技术也会随着人类的发展，一点一点变得更加完美！染色体分带技术的精进，会使人类越来越了解染色体，从而可以从根本上解决一些疾病的治疗。我相信染色体分带技术将会被广泛应用于生物科学的研究领域中。此论文仅是我查阅资料后，所得的一家之言，希望老师能批评指正。参考文献植物染色体Giemsa 分带技术的研究，陈瑞阳等染色体分带技术的进展，高明君染色体分带技术的回顾与展望，施立明染色体分带技术及其现状，朱季美
