1、分类号 密级 UDC 注 1 学 位 论 文类芽孢杆菌 ZC01 胞外多糖的制备和 生 物 活 性 的 研 究（题名和副题名） 陈金苹（作者姓名）指导教师姓名 张建法 教授 申请学位级别 硕士 专业名称 生物化工 论文提交日期 2014. 论文答辩日期 2014 学位授予单位和日期 南 京 理 工 大 学 答辩委员会主席 评阅人 2014 年 月 日注 1：注明国际十进分类法 UDC的类号。硕 士 学 位 论 文类芽孢杆菌 ZC01 胞外多糖的制备和生物活性的研究作 者：陈金苹指导教师：张建法 教 授南 京 理 工 大 学2014 年 月Master Degree DissertationPr
2、eparation and biological activity study for an extracellular polysaccharide produced by Paenibacillus sp.ZC01 ByJinping ChenSupervised by Prof. Jianfa ZhangNanjing University of Science & TechnologyMarch, 2014声 明本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学
3、历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均已在论文中作了明确的说明。研究生签名： 年 月 日 学位论文使用授权声明南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。研究生签名： 年 月 日硕士论文 类芽孢杆菌 ZC01 胞外多糖的制备和生物活性的研究I摘 要近些年来，微生物保胞外多糖作为一种新的发酵产品，因为其具有独特的物理化学性质，易于获得，成本相对较低，而被广泛应用于各个行业。本实验室从河南某农田的土样中分离
4、培养出一株产胞外多糖的新菌株 ZC01。该菌能够在无机盐培养基上生长，通过初步鉴定和 16S rDNA 同源性分析，确定该菌是一种类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.ZC01)。采用乙醇沉淀法，将 ZC01 菌的发酵液中的代谢产物沉淀析出并烘干，即可得到胞外多糖的粗品。通过单因素法优化发酵条件，得到产胞外多糖最高时的发酵条件为：可溶性淀粉 30 g/L，蛋白胨 4 g/L，磷酸氢二钠 1.2 g/L，磷酸二氢钾 0.6 g/L，氯化钙 0.1 g/L，氯化镁 0.3 g/L，硫酸亚铁 0.0125 g/L，硫酸锰0.003 g/L， 氯化锌 0.01 g/L，水 1L，pH8.0，
5、28。发酵液最高产量可达到15.5g/L。该菌所产的胞外多糖，各化学组分含量分别为水分 8.65%、蛋白 16.24%、灰分 10.9%、总糖 64.01%。通过分离纯化，气相色谱、红外光谱、核磁共振以及糖残基测定，确定该胞外多糖由四种单糖组成，是一种杂多糖。四种单糖成分分别为葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖，这四种单糖的摩尔比为1.21.20.71。并且发现多糖中含有一定量的糖醛酸，是一种酸性杂多糖。本实验还研究了多糖的吸水保湿效果和抗氧化性能，发现了该多糖具有与透明质酸相似的吸水保湿性能，具有良好的清除自由基的能力。因此，研究证明该多糖有广泛的应用前景，能大量应用于化妆品行业。关键词：类芽孢
6、杆菌 ZC01，多糖，抗氧化，吸水，保湿，分离纯化Abstract 硕士论文IIAbstractIn recent years, microorganisms extracellular polysaccharide, as a kind of new fermentation products, because of its unique physical and chemical properties, such as easily available, relatively low cost, is widely applied in various industries. A new
7、strain ZC01 was isolated from a soil sample from Henan farmland in our laboratory. The bacteria could use inorganic medium to produce extracellular polysaccharide. According to preliminary identification and 16S rDNA homology analysis, the bacteria was identified as the genus Paenibacillus (Paenibac
8、illus sp.ZC01).By ethanol precipitation, the fermented liquid was added more than 2 times of ethanol, the metabolic product was precipitated out and dried, the crude products of the extracellular polysaccharide would be obtained. The fermentation conditions were optimized through single factor, the
9、best fermentation conditions to produce more Extracellular polysaccharide was studied in this paper. Its media component was Soluble starch 30 g/L, peptone 4 g/L, disodium hydrogen phosphate 1.2 g/L, potassium dihydrogen phosphate 0.6 g/L, calcium chloride 0.1 g/L, magnesium chloride 0.3 g/L, ferrou
10、s sulfate, 0.0125 g/L, manganese sulfate, 0.003 g/L, zinc chloride 0.01 g/L, 1 L water, pH8.0, 28 . the maximum yield could reach 15.5 g/L.The chemical composition of exopolysaccharide are moisture 8.65%, protein 16.24%, total sugar 64.01%, ash 10.9%. Through separation and purification, gas chromat
11、ography, infrared spectrum, nuclear magnetic resonance (NMR) and sugar residue determination, the extracellular polysaccharide was found is a kind of heteropolysaccharide composed of four kinds of monosaccharides. Four kinds of monosaccharide composition were glucose, mannose, galactose, rhamnose, t
12、heir molar ratio was 1.2:1.2:0.7:1. And the exopolysaccharide is found to contain a certain amount of uronic acid, is a kind of acidic heteropolysaccharide. We studied moisture-retention capacities and antioxidant of the exopolysaccharide. We found that the polysaccharide has moisture-absorption and
13、 -retention capacities and the well capable of scavenging free radicals compared with hyaluronic acid. Therefore, All the results from this paper have shown that the polysaccharide has a widely application prospect and could be used to in cosmetics.Keywords: Paenibacillus sp.ZC01, polysaccharide, an
14、tioxidant, Moisture absorption, Moisture retention, separation and purification 硕士论文 类芽孢杆菌 ZC01 胞外多糖的制备和生物活性的研究III目 录摘 要 .IAbstract .II目 录 .III1 绪论 .11.1 多糖的研究 .11.1.1 植物多糖 .11.1.2 动物多糖 .11.1.3 海藻多糖 .21.1.4 微生物多糖 .21.2 微生物胞外多糖的生物活性 .31.2.1 免疫调节活性 .31.2.2 抗肿瘤活性 .31.2.3 降血糖和降血脂作用 .41.2.4 抗氧化活性 .41.3 微
15、生物胞外多糖的应用 .41.3.1 胞外多糖在医疗方面的应用 .51.3.2 胞外多糖在食品行业的应用 .51.3.3 胞外多糖在化妆品方面的应用 .61.3.4 胞外多糖在环境方面的应用 .71.4 本课题的目的、意义及主要研究内容 .71.4.1 课题的目的和意义 .71.4.2 主要研究内容 .72 类芽孢杆菌 ZC01 胞外多糖的初步鉴定 .82.1 材料与方法 .82.1.1 主要试剂 .82.1.2 主要仪器 .92.1.3 菌种筛选来源 .102.1.4 ZC01 菌的初步鉴定方法 .102.1.5 菌种的保藏 .122.1.6 胞外产物性质的确定 .132.2 结果与讨论 .1
16、32.2.1 菌种的培养 .13目录 硕士论文IV2.2.2 菌株的初步鉴定 .132.2.3 ZC01 菌的 DNA 提取和 PCR 实验 .142.2.4 ZC01 菌的 16s rDNA 系统发育分析 .162.3 本章小结 .163 类芽孢杆菌 ZC01 发酵产胞外多糖条件的优化 .183.1 材料与方法 .183.1.1 实验材料与试剂 .183.1.2 主要仪器 .183.1.3 实验方法 .193.1.4 实验设计 .193.2 结果与讨论 .203.2.1 碳源对发酵液粘度和产量的影响 .203.2.2 氮源对发酵液粘度和产量的影响 .213.2.3 pH 值对发酵液粘度和产量
17、的影响 .223.2.4 温度对发酵液粘度和产量的影响 .233.2.5 无机盐离子对发酵液粘度和产量的影响 .233.3 本章小结 .244 多糖的组成和组分的分析 .264.1 材料与方法 .264.1.1 主要试剂 .264.1.2 主要仪器 .274.1.3 胞外多糖的提取、制备、分离纯化 .284.1.4 多糖化学组成的测定方法 .284.1.5 多糖结构的测定方法 .294.2 结果与讨论 .304.2.1 ZC01 菌胞外多糖的制备，分离纯化 .304.2.2 胞外多糖的化学组成 .314.2.3 多糖结构的测定与分析 .314.3 本章小结 .365 胞外多糖的生物活性的研究 .375.1 材料与方法 .375.1.1 实验材料与试剂 .375.1.2 实验主要仪器 .375.1.4 胞外多糖的吸湿和保湿作用的研究 .38硕士论文 类芽孢杆菌 ZC01 胞外多糖的制备和生物活性的研究V5.1.5 胞外多糖抗氧化性能的研究 .385.2 结果与讨论 .405.2.1 胞外多糖的吸水保湿实验 .405.2.2 胞外多糖的体外抗氧化实验 .425.3 本章小结 .446 结论 .456.1 研究小结 .456.2 本课题接下来的研究方向 .46致谢 .47参考文献 .48
