1、柴 永 川 苏州大学附属第一医院 耳鼻咽喉科,耳聋基因检测与一级预防,耳聋防治 是重大医学难题,全球听力障碍人数(WHO),N Engl J Med. 2007,耳聋基础,数据来自：第二次（2006年）全国残疾人抽样调查,中国耳聋人群庞大,耳聋基础,先天性听力障碍发病率： 1-3全国每年新增耳聋患儿： 2-6万,先天性听力障碍发病率高,每10000新生儿中先天性出生缺陷的发生率,耳聋基础,导致严重后果：语言障碍（十聋九哑） 目前无有效治疗方法，主要依赖助听器与人工耳蜗植入等辅助手段 影响终生：家庭社会负担沉重 每个听障患儿增加社会成本约20-50万元,先天性听力障碍危害性高,耳聋基础,效果依赖
2、早期发现、早期诊治和防控,助听器验配,人工耳蜗植入,先天性听力障碍高度可干预性,言语康复训练,耳聋基础,先天性耳聋防治思路,东部地区,中部地区,西部地区,UNHS及干预网络 的建立与实施,聋病基因孕前产前筛查 降低出生率,高危因素筛查及干预 模式的建立与实施,关口前移,重心下移,重心下移,偏远地区,重心下移,儿童保健网络 筛查及干预,耳聋基础,耳聋的病因复杂： 遗传性病因占主要部分,明确的遗传因素为耳聋的预防创造条件,耳聋基础,非综合征性耳聋基因60个 显性 30个 隐性 50个 线粒体 2个 X-连锁 4个综合征性耳聋基因40个,遗传性耳聋具高度遗传异质性,Hereditary hearin
3、g loss Homepage,耳聋基础,常见耳聋基因少，占遗传因素多,Journal of translational medicine:GJB2 mutation spectrum in 2063 Chinese patients with non-syndromic hearing impairment,American journal of medical genetics:Molecular etiology of hearing impairment associated with non-syndromic enlarged vestibular aqueduct in East
4、 China., American journal of human genetics :Maternally inherited aminoglycoside-induced and nonsyndromic deafness is associated with the novel C1494T mutation in the mitochondrial 12S rRNA gene in a large Chinese family.,针对常见耳聋基因的一级预防具有高度可行性,常见耳聋基因占遗传性耳聋50%以上，药物性耳聋40%以上 GJB2 （40%-50%） SLC26A4 （15%-
5、20%） 线粒体基因 （40%以上药物性耳聋）,常见耳聋基因检测,基因检测与婚育指导,产前诊断,常见耳聋基因筛查,常见耳聋基因检测,聋病基因筛查在北京、上海等重点城市已得到初步开展，筛查技术成熟 GJB2 SLC26A4 线粒体DNA突变热点,常见耳聋基因筛查,常见聋病基因筛查使先天性听力障碍的预防成为可能,常见耳聋基因检测,耳聋基因筛查与预防模式,高危筛查模式 目标：高危人群（耳聋人群及其亲属等） 筛查手段：全序列测定为主（GJB2、SLC26A4和MT-RNR1） 筛查时间：孕前、婚前、恋前 普遍筛查模式 目标：正常听力人群 筛查手段：快速筛查为主，序列测定为辅(GJB2、SLC26A4和
6、MT-RNR1三大基因的热点突变) 筛查时间：孕前或孕早期,常见耳聋基因检测,耳聋基因高危筛查,试点及合作单位：上海市长宁区残联会员,常见耳聋基因检测,GJB2双等位基因突变（29.5%）,SLC26A4双等位基因突变（14.1%）,线粒体基因突变（6.0%）,原因不明：（50.3%),常见耳聋基因突变检出比例：49.7%,耳聋基因高危筛查,N200例,常见耳聋基因检测,耳聋基因高危筛查,优缺点分析,常见耳聋基因检测,耳聋基因普遍筛查,育龄或孕早期女性,隐性基因突变携带者,配偶基因芯片筛查,耳聋基因芯片筛查,夫妇双方均为同证基因突变携带者,线粒体A1555G突变,产前基因诊断,遗传咨询,药物性
7、耳聋遗传咨询,常见耳聋基因检测,有效检测样本（怀孕早期孕妇）：3056例 孕妇中携带耳聋基因突变160例，占总样本的5.23%。 携带者自身均听力正常，157例无家族史，3例MT突变孕妇家族多人有药物性聋病史。 MT突变7例，对母系成员进行氨基糖苷类抗生素药物预警，以避免药物性耳聋 全序列检测非MT突变的阳性孕妇配偶124例，13家庭具隐性遗传性耳聋生育风险， 5例进行了产前诊断，1例胎儿为p.V37I/c.235delC复合杂合，其余为突变携带或野生型。,耳聋基因普遍筛查,常见耳聋基因检测,耳聋基因普遍筛查,优缺点分析,常见耳聋基因检测,耳聋基因诊断与遗传咨询实例,产前基因诊断可有效预防隐性
8、遗传性耳聋的再生育风险,耳聋遗传咨询,父母耳聋，孩子个个耳聋,同证婚配：后代100%会耳聋,耳聋基因诊断与遗传咨询实例,聋人婚前进行耳聋基因检查，可避免同证婚配的出现,耳聋遗传咨询,AA;bb aa;BB,?,携带不同隐性耳聋基因突变的聋人夫妇可生育正常听力的孩子,耳聋基因诊断与遗传咨询实例,耳聋遗传咨询,Bb,耳聋基因诊断可为遗传性耳聋高危人群提供生育风险评估及预防,耳聋基因诊断与遗传咨询实例,耳聋遗传咨询,C,?,携带线粒体耳聋基因突变的人群通过指导可避免药物性耳聋的发生,耳聋基因诊断与遗传咨询实例,耳聋遗传咨询,耳聋基因遗传咨询与诊断,了解病因，帮助确诊预防下一代聋病的发生预防亲属或下一
9、代药物性耳聋的可能,耳聋遗传咨询,罕见已知耳聋基因检测,非常见耳聋基因致病患者的分子病因罕见已知耳聋基因致病？罕见已知耳聋基因众多，如何检测？,罕见耳聋基因检测,本研究所检测的79个耳聋基因,常见的耳聋致病基因：Sanger测序,罕见耳聋基因检测：定向捕获二代测序 可行性分析：OtoSCOPE芯片（54个已知耳聋基因，2010年，University of Iowa） 79个已知耳聋基因的二代测序（本研究）,2010年二代测序首次应用于已知耳聋基因检测,适宜的检测技术,罕见已知耳聋基因检测,罕见耳聋基因检测,总样本量：183例,经济高效的检测方案,检测方案（二步法） 第一步：常见耳聋基因San
10、ger测序（所有样本） 第二步：79个耳聋基因二代测序（排除常见耳聋基因致病样本）,二步法优点：节约二代测序样本数量,罕见已知耳聋基因检测,罕见耳聋基因检测,79个已知耳聋基因病因构成图,常见耳聋基因突变：35.5% GJB2: 19.7% SLC26A4：12.0% MT-RNR1: 3.8%罕见耳聋基因突变：15.8%,罕见已知耳聋基因病因构成：15.8%,罕见已知耳聋基因检测,罕见耳聋基因检测,罕见耳聋基因的异质性强,罕见基因突变分布图,致病突变广泛分布于15个基因中,新发突变占绝大多数,致病突变是否报道分布图,Orphanet Journal of Rare Diseases 2013
11、, 8:85,罕见已知耳聋基因检测,罕见耳聋基因检测,新耳聋基因克隆与发现,所有已知耳聋基因检测后都为阴性新耳聋基因致病？ 已知耳聋基因非编码区致病？ 已知耳聋基因大片段缺失？ ,新耳聋基因克隆,遗传性耳聋家系连锁分析,遗传标记,基因型分离,表型分离,基因型-表型共分离,耳聋基因的定位克隆,新耳聋基因克隆,外显子捕获/二代测序,二代测序,耳聋基因定向外显子捕获/测序平台排除已知耳聋基因增加克隆新耳聋基因的把握,新耳聋基因克隆,Genome-Wide Linkage Analysis,Performed in 9 affected and 9 unaffected (35 yrs),新耳聋基因克
12、隆,候选区域,新耳聋基因克隆,Genome-Wide Linkage Analysis,9 affected and 8 unaffectedIllumina OmniZhongHua BeadChip (900,015 SNPs) Chr16p13kgp1005458-kgp2546988 (2.1 Mb)Maxium LOD = 3.8Overlapped with DFNB86 interval,新耳聋基因克隆,Whole Exome Sequencing,3 affected and 2 unaffected,新耳聋基因克隆,Whole Exome Sequencing,Candida
13、te variants: non-synonymous variants (missense, nonsense, splicing site, indels, etc) with allele frequencies 0.001,II-3,III-9,III-7,III-5,III-11,II-3, III-7, III-9: Affected III-5, III-11: Unaffected,新耳聋基因克隆,Whole Exome Sequencing,Confirmed by Sanger sequencing in all family members,新耳聋基因克隆,Genome-
14、Wide Linkage Analysis,9 affected and 8 unaffectedIllumina OmniZhongHua BeadChip (900,015 SNPs) Chr16p13kgp1005458-kgp2546988 (2.1 Mb, 124 genes)Maxium LOD = 3.8Overlapped with DFNB86 interval,新耳聋基因克隆,The p.Ser178Leu Variant of TBC1D24,Highly conservative Not seen in 1000 normal hearing controls,新耳聋基
15、因克隆,Hum Mutat，2014, 35(7):814-818,TBC1D24,新耳聋基因克隆,耳聋基因检测技术：一代测序,DNA抽提 PCR扩增 扩增片段测序 突变检测优点：可覆盖目标基因全部编码序列，适合特定目标诊断,总结-检测技术,高通量定点突变检测技术,耳聋基因突变芯片检测法 飞行时间质谱法 SNAPshot/HRM等优点：通量高，操作简便，适合大规模人群筛查,总结-检测技术,外显子目标 捕获结合二代测序,优点：覆盖绝大多数（140个）已知耳聋基因编码序列,Orphanet J Rare Dis, 2013, 8(1):85,总结-检测技术,耳聋基因研究与临床应用,临床应用,基础研究,,总结,谢谢！,
