1、硕士学位论文HIV-1 Tat38-61(51N/55N)碱性区突变体库的构建及亲和筛选Construction of HIV-1 Tat38-61(51N/55N) Basic Region Mutation Libraries and Affinity Screening独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其它人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日学位论文使用授权书声明本人完
2、全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日第二军医大学硕士学位论文 目 录-1-目 录中文摘要 .1ABSTRACT.5缩略词表 .10前 言 .11第一部分 HIV-1 TAT(38-61)融合蛋白的表达及免疫原性分析 .131. 实验材料 .152. 实验方法 .20
3、3. 实验结果 .234. 讨 论 .27第二部分 HIV-1 TAT38-61(51N/55N)碱性区突变体库的构建 .291. 实验材料 .312. 实验方法 .333. 实验结果 .364. 讨 论 .40第三部分 HIV-1 TAT38-61(51N/55N)碱性区突变体库的亲和筛选 .421. 实验材料 .432. 实验方法 .433. 实验结果 .454. 讨 论 .47总 结 .49综 述 .50参考文献 .55附 录 个人简历 .57致 谢 .58第二军医大学硕士学位论文 中文摘要-1-中文摘要人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）
4、归属于逆转录病毒科中慢病毒属，主要经血液、性接触及母婴垂直途径等传播，可引起获得性免疫缺陷综合症（Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS） ，即艾滋病。目前，艾滋病感染已经成为全球所面临的重大公共卫生问题。研制有效的 HIV 疫苗是艾滋病防治的重要手段之一。因此，探索 HIV 疫苗研究的新策略和寻找新的疫苗靶点对疫苗的成功研发显得尤为重要。HIV-1 反式激活蛋白 (Trans-activator of transcription，Tat) 是 HIV 感染早期产生的一种重要调控蛋白，在 HIV-1 的复制、扩散和致病中起重要作用。HIV-1 感染靶细
5、胞后，胞质中合成的 Tat 转移到核内，与多种转录调控因子结合组成转录起始复合体（transcription initiation complex, TIC）,促进病毒 RNA 的转录、延伸和病毒复制。此外，Tat 还可被感染细胞通过多种方式分泌到胞外发挥“ 病毒毒素”的作用：通过诱导 CD4+ T 细胞、NK 细胞或 B 细胞的凋亡，发挥其免疫抑制的作用；通过JAK/STAT 信号转导途经激活 HHV-8 的复制，或通过 RGD(Arg-Gly-Asp)与内皮细胞 v3 和 51 整合素结合，与可溶性炎症因子和血管生成因子协同促进卡波济肉瘤（Kaposis sarcoma,KS）的形成；通过
6、影响神经细胞钙流，诱导巨噬细胞和小胶质细胞表达 TGF-、TNF 等神经毒性物质，发挥神经毒作用，促进艾滋病脑病的发生。Tat 碱性氨基酸富集区 (49-57aa)是 Tat 的穿膜和核定位功能基序，是 Tat 蛋白的主要中和表位之一。其中和抗体可消除 Tat 分子所特有的穿入其他细胞发挥毒性的核心功能，从机制上能对阻止艾滋病和免疫抑制的发生有重要作用。此外，Tat 碱性区序列在各亚型间高度保守，有利于产生交叉反应谱更广的抗体。本研究拟利用噬菌体展示技术分子进化平台，对天然 Tat 碱性区进行重组改造和筛选，构建由碱性区突变片段经随机连接肽相互连接的重复串联的噬菌体展示文库，用含有高中和活性的
7、抗-Tat 兔抗血清进行进化筛选，获得新型免疫原的代表性序列。本研究分以下三部分进行：一、 HIV-1 Tat(38-61)融合蛋白的表达及免疫原性分析功能研究表明：Tat 蛋白碱性区（ 49-57aa）介导 Tat 蛋白穿膜，与 Tat 细胞外活性密切相关。结构研究表明：Tat 分子为天然非折叠蛋白，属于无规则卷曲类型的分子，缺乏稳定的二级结构和高级结构，其分子构想极不稳定，出于快速动态的变化第二军医大学硕士学位论文 中文摘要之中，导致以 Tat 作为抗原，刺激效果差，高亲和力的抗体较少且容易被降解。此外，Tat 碱性区只有 9 个氨基酸（ 49-57aa） ，为了不破坏其中和表位，我们保留
8、了Tat 核心区（38-48aa） ，将 Tat 的 38-61 碱性区片段构建到原核表达载体，纯化出Tat(38-61)融合蛋白并检测其免疫原性，以分析此肽段重要的中和表位是否能够得到保留。根据大肠杆菌偏好密码子优化后的 HIV-1 型株 Tat DNA 序列设计引物，用 PCR方法合成 HIV-1 tat(38-61)序列，T/A 克隆法将其克隆到 pMD18-T 载体进行测序。将测序正确的 tat(38-61)克隆至原核表达载体 pET32a，构建其原核表达质粒 pET32a-tat(38-61)。将表达质粒转入 E.coli BL21(DE3)中，IPTG 诱导表达出相对分子量为213
9、00 的融合蛋白，并用 Ni-NTA 亲和层析法纯化目的蛋白。用本实验室独立制备的兔抗 PEPTIDE-Tat(1-101) 血清和上海市公共卫生中心提供的 HIV 阳性血清进行ELISA 检测，分析 Tat（38-61）融合蛋白的免疫原性。结果显示：为排除融合蛋白中 PET32a 分子的干扰，我们选用兔抗 Tat(1-101)-PEPTIDE 血清鉴定 pET32a 载体上表达的 Tat(38-61)（pET32a 载体与 pPETTIDE 载体序列无同源性） 。结果表明二者呈特异反应且反应强度低于 PET32a-Tat(1-101)，与预期相符。为了彻底排除载体分子 PET32a 的干扰，
10、我们用 HIV 阳性血清（含抗 Tat 单抗，无载体分子干扰）进行鉴定，结果显示表明 Tat(38-61)、全长 Tat 二者与 HIV 阳性血清有基本一致的特异性反应趋势。以上 ELISA 测定结果说明 Tat(38-61) 较好地保留了 Tat 碱性区的中和表位。综上所述，我们成功构建并表达出 Tat(38-61)融合蛋白，碱性区肽段的重要表位得到保留，为进一步针对碱性区中和抗体的制备和噬菌体展示文库的筛选奠定基础。二、 HIV-1 tat38-61(51N/55N)碱性区突变体库的构建研究表明，碱性区两个重要的位点 51K 和 55R 定点突变后，不仅其中和表位未被破坏，且 Tat 穿膜
11、活性和胞外毒性消失或是被大大减弱。此外，构建适合的大容量生物大分子变异体文库是进行体外分子进化研究的关键。因此，为了扩大碱性区基因序列中被筛选的范围，我们采用含随机核苷酸序列的引物，通过 Overlap PCR的方法对碱性区两个位点 51K 和 55R 进行了随机突变，使之转变成 51N 和 55N。同时在碱性区 61 位后引入 6 个随机连接肽(SNN) 6，不仅扩大文库的变异体，而且随机连接肽可与中和表位序列之间相互作用,有助于产生稳定构象的新型免疫原。经过四轮 PCR 得到 tat38-61(51N/55N)突变体片段，通过 Xba I 酶切后，克隆至噬菌体展示载体 pCANTAB5S-
12、LD3 上，转化超级感受态 Top10 细胞，建立 HIV-1 第二军医大学硕士学位论文 中文摘要-3-株 Tat38-61(51N/55N)碱性区突变体文库。辅助噬菌体 M13K07 拯救后，得到Tat38-61(51N/55N)碱性区重组噬菌体原代展示文库。所得到的噬菌体展示文库的库容量为 5.0106，滴度为 2.651012 TU/ml，片段插入率为 70%；14 个经 PCR 验证的阳性克隆序列分析显示 Tat38-61(51N/55N)碱性区片段中 51N-55N-(SNN)6 中随机化的核苷酸与氨基酸均呈随机性分布。综上所述，我们成功构建了 HIV-1 株 Tat38-61(51
13、N/55N)碱性区突变体文库，并且其库容、多样性、随机性均达到文库构建要求。三、 HIV-1 tat38-61(51N/55N)碱性区突变体库的亲和筛选通过第一部分的鉴定，我们发现碱性区肽段可以较好的保留其中和表位，我们用两种兔抗血清：兔抗 PET32 -Tat(38-101)和兔抗 PET32 -Tat(1-101)，同时对 HIV-1 株 Tat38-61(51N/55N)碱性区突变体文库进行亲和筛选，以期获得亲和力更强，穿膜活性更低新型免疫原的代表性序列。通过两种兔抗血清同时对文库进行两轮筛选，每轮结束后，挑取单克隆进行 PCR 鉴定，并对 PCR 鉴定过的阳性克隆进行序列分析。PCR
14、鉴定结果显示:兔抗 PET32 - Tat(1-101)血清对文库筛选后，包含 2 个碱性区片段的单克隆在文库中所占的比例由筛选前的 56%下降到 4%，而包含单个碱性区片段的单克隆在文库中所占的比例由筛选前的 39%上升到 91%。与此结果相类似，兔抗 PET32 - Tat(38-101)血清对文库筛选后，包含 2 个碱性区片段的单克隆在文库中所占的比例由筛选前的 56%下降到 0，而包含单个碱性区片段的单克隆在文库中所占的比例由筛选前的 39%上升到 87%。理论上，通过连接肽串联重复多个碱性区片段形成的大分子多肽，由于亲和力的关系，抗原表位重复次数多具有选择性优势，容易被进化筛选获得。
15、但两轮筛选后片段结构的变化，似乎说明碱性区中 51N-55N-(SNN)6 较大分子多肽对中和反应具有更重要的作用。序列鉴定分析显示:PET32 - Tat(1-101)血清对文库两轮筛选后的单克隆中，碱性区片段与载体反向连接的比例达到 50%，兔抗 PET32 - Tat(38-101)血清对文库两轮筛选后的单克隆中，碱性区片段与载体反向连接的比例只有 6%，说明兔抗PET32 - Tat(38-101)血清对 Tat(38-61)肽段的亲和力要高于 PET32 - Tat(1-101)血清，这也与理论相符，因为 PET32 - Tat(1-101)血清中除了包含针对碱性区的抗体，还包含了针
16、对 N-端区 (1-22)的抗体，而 PET32 - Tat(38-101)血清只包含了针对碱性区的抗体。兔抗 PET32 - Tat(1-101)血清第二轮筛选后的正确连接单克隆中， 51N 和 55N有更多比例的脯氨酸（P ） 。而兔抗 PET32 - Tat(38-101)血清第三轮筛选后的正确连接单克隆中，筛选到两种序列，51N-55N-(SNN) 6 分别是为 P-D- MNKNE*(*为终止第二军医大学硕士学位论文 中文摘要密码子)和 Q-S-*KRKMN(*为终止密码子)。综上所述，我们成功用两种兔抗血清对文库进行了筛选，并用亲和力更强的兔抗 PET32 - Tat(38-101
17、) 血清进行三轮筛选后获得两种 51N-55N-(SNN)6 代表性序列。本课题构建了 pET32a-tat(38-61)原核表达质粒并纯化鉴定了 Tat(38-61)融合蛋白的免疫原性,为后续使用兔抗 Tat 血清对碱性区突变体文库筛选奠定了基础；成功构建了 HIV-1 株 Tat38-61(51N/55N)碱性区突变体文库并用两种兔抗血清 PET32 - Tat(38-101) 和 PET32 - Tat(1-101)对文库进行了筛选，通过亲和力更强的兔抗 PET32 - Tat(38-101) 血清对文库第三轮筛选后，获得了 51N-55N-(SNN)6 两种代表性序列 P-D- MNK
18、NE*(*为终止密码子)和 Q-S-*KRKMN(*为终止密码子 )。本研究尝试应用以噬菌体展示技术为基础的分子进化手段对 HIV-1 株 Tat 碱性区进行改造和筛选，为生物大分子的结构和功能研究以及新型疫苗研发策略提供了一新的可行途径。【关键词】HIV-1 Tat，碱性区，随机突变，噬菌体展示，亲和筛选第二军医大学硕士学位论文 英文摘要-5-ABSTRACTHuman immunodeficiency virus (HIV) is attributed to the slow Retroviridae virus, spreading mainly through blood, sexua
19、l contact or mother to child such as vertical channels, which can cause Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS). At present, HIV infection has become a major public health problem which has to be faced by the world. Developing an effective HIV vaccine is an important means of prevention and contr
20、ol of AIDS. Therefore, it is very important for exploring new strategies and finding new vaccine targets on the success of the vaccine research and development.HIV-1 Tat (trans-activator of transcription) is a key viral regulatory protein emerged in the early stage of HIV infection, and is necessary
21、 for viral replication, spreading and pathogenesis. After infecting target cells, the Tat generated in cytoplasm can reach the nucleus and bind with some Transcription factors to form the transcription initiation complex (TIC), which can promote transcription, extension and replication of the viral
22、RNA. In addition, Tat can also be secreted from infected cells into the extracellular with a variety of ways in order to play a “virus toxins“ role:playing an immunosuppressive function By inducing CD4 + T cells, NK cells or apoptosis B cells; promoting the formation of Kaposis sarcoma (KS) through
23、some ways ,such as activating HHV-8 replication via JAK / STAT signal transduction, or binding the RGD (Arg-Gly-Asp) with v3 and 51 integrins of the endothelial cells; promoting the incidence of HIV encephalopathy through affecting calcium flow in the nerves cells or inducing the expression of TGF-,
24、 TNF and other neurological toxic substances. Tat basic amino acid-rich region (49-57aa) is the base sequence of functioning the trans-membrane and nuclear localization, and is also one of the main neutralization epitope. Its neutralizing antibody can eliminate the penetration of other cells, which
25、can prevent the occurrence of AIDS and immune suppression. In addition, Tat basic region sequences highly conserved among the various subtypes, which is conducive to creating a broader cross-reactivity antibodies. In This study we construct and screen of Tat basic region using phage display technolo
26、gy platform, and build the mutant peptide fragment library connected by random Linkers, and then screen the library using anti-Tat rabbit serum in order to obtain the original sequence of novel immunogen.1. Expression and immunogenicity analysis of HIV-1 Tat(38-61) fusion proteins第二军医大学硕士学位论文 英文摘要Fu
27、nctional studies have shown that Tat protein basic region (49-57aa) is playing an important role for trans-membrane function and extracellular activities mediated by Tat. Structural studies have shown that: Tat is a natural non-folded protein, and its concept is extremely unstable, so its not an ide
28、al antigen. In addition, Tat basic region has only nine amino acids (49-57aa), in order not to destroy the epitope we have maintained the Tat core region 38-48aa. The Tat basic region of 38-61 fragment was built into the prokaryotic expression vector, then we purified Tat (38-61) fusion protein and
29、tested their immunogenicity in order to analyze whether this important epitope is retained.The primers were designed according to the Tat sequence of HIV-1 strain and the preferred codons of E.coli. The tat(38-61) were synthesized in vitro by PCR and sequenced after inserted into pMD18-T vector by T
30、/A cloning. Then the correct tat(38-61) was inserted into pET32a vector to construct prokaryotic expression plasmids pET32a-tat(38-61) and . The recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21(DE3) for expression .The fusion protein Tat(38-61) was expressed with relative molecular weight(MW) 21
31、300 under induction of IPTG, purified by Ni-NTA column and testified with Two different anti-Tat rabbit serum and HIV-positive serum by ELISA. The results showed that: To exclude the interference of the carrier protein( PET32a), we identified Tat (38-61) expressed by the pET32a vector using rabbit a
32、nti-PEPTIDE-Tat (1-101) serum (the two vector sequence are no homology). The result shows that there is a specific reaction and the reactivity much lower than the native Tat, which is in line with expectations. To completely exclude the interference of the carrier protein ( PET32a), we identified Ta
33、t (38-61) using HIV-positive serum (containing only anti-Tat antibody). The result shows that both Tat (38-61) and the native Tat(1-101) have the same specific reaction trend. ELISA detection of the above results suggest that the neutralization epitope of Tat basic region has been preserved by Tat (
34、38-61).To conclude, we successfully constructed and expressed Tat(38-61) fusion proteins, and its neutralization epitope of Tat basic region has been preserved, which laid the foundation on getting the antibodies against the basic region and screening phage display library . 2. Construction of HIV-1 tat38-61 (51N/55N) basic region mutant libraryStudies have shown that after two important sites（51K and 55R）of the Tat basic region are mutated, the neutralization epitop is not destroyed, and the activity of Tat trans-
