1、酶 化 学,金陵学院 2010,酶的概念 酶的活力 酶促反应动力学 调节酶,一、酶的概念,酶是由生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。,Snail without enzyme catalyst,Snail with enzyme catalyst,Substrates,Product,酶是由生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。,酶与一般催化剂的比较：,共性： 用量少而催化效率高； 只能改变化学反应的速度，不改变化学反应的平衡点，酶本身在化学反应前后也不改变； 可以降低反应的活化能；,例 2H2O22H2O+O2,个性： 催化效率更高； 具有高度的专一性； 酶容易失活； 酶活力受调控
2、； 酶活力与辅助因子有关；,p.210,2H2O22H2O+O2,1mole H2O2酶： 能催化 5106mole H2O2的分解,1mole Fe3+ ： 只能催化 610-4mole H2O2的分解,催 化 效 率 更 高,以摩尔为单位进行比较，酶的催化效率比化学催化剂高1071013倍，比非催化反应高1081020倍。,酶的专一性,绝对专一性-只作用于一种底物；,p.214,相对专一性- 作用于结构类似的一系列化合物； 族专一性（基团专一性）：,键专一性：,A B,立体专一性-要求底物有一定的化学结构； 旋光异构专一性L-AA氧化酶 几何异构专一性,区分对称的基团,解释： 1894年，
3、E.Fischer 提出的锁钥学说 1958年，Koshland 提出的诱导契合假说,p.215,锁钥学说（lock and Key theory）,三点附着学说,诱导契合学说（induced-fit theory）,大多数酶的化学本质是蛋白质,J.B.Sumner 1926年得到脲酶结晶,J.H.Northrop等1930年得到胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的结晶,酶容易失活,少数RNA具有催化活性,Thomas Cech University of Colorado at Boulder, USA,1982年发现四膜虫的rRNA前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工。,1983年发现
4、RNaseP（由20%蛋白质和80%的RNA组成）中的RNA可催化E. coli tRNA的前体加工。,Sidney Altman Yale University New Haven, CT, USA,Cech和Altman各自独立地发现了RNA的催化活性，并命名这一类酶为 ribozyme（核酶），2人共同获1989年诺贝尔化学奖。,1Cell vol 31, 147157，1982年。,2Sci. Amer. Vol 255, 6475，1986。,Protein,RNA,Enzymes,酶的化学本质是-,酶活力受调控,酶浓度的调节 激素调节 反馈调节 抑制剂和激活剂的调节 别构调节 酶的
5、共价修饰调节 酶原活化,单纯蛋白质 结合蛋白质-蛋白质 + 非蛋白质组分全酶 = 酶蛋白 + 辅助因子辅助因子：辅酶、辅基、金属离子等在化学反应中的作用：酶蛋白决定酶反应的专一性和高效率；辅助因子直接传递电子、原子或化学基团；,酶活力与辅助因子有关,酶的组成：,酶的命名和分类,1961年国际酶学委员会（enzyme commission）提出的酶的命名和分类方法。,p.193,酶 的 命 名：,习惯命名： 依据底物命名：淀粉酶，蛋白酶，核酸酶 依据催化的反应性质：水解酶，转氨酶 结合上述两个原则：琥珀酸脱氢酶，葡萄糖氧化酶 加上酶的来源或特征：胃蛋白酶，牛胰核糖核酸酶,标明底物与反应类型：,G
6、-6-PF-6-P,系统命名：,葡萄糖-6-磷酸异构酶,两个底物参加反应时应同时列出，中间用冒号分开。如其中一个底物为水时，水可略去。,丙氨酸 + -酮戊二酸 谷氨酸 + 丙酮酸,丙氨酸:-酮戊二酸氨基转移酶,脂肪 + H2O 脂酸 + 甘油,脂肪水解酶,酶的分类：,氧化还原酶类； 转移酶类； 水解酶类； 裂合酶类； 异构酶类； 连接酶类；,类亚类亚-亚类无特殊规定的排号 EC1.1.1.1 （Enzyme Commission） 表示：氧化还原酶类作用于-CHOH基团的亚类受体为NAD或NADP的亚亚类排号为1,六大类酶催化反应的性质,1氧化还原酶类（oxido-reductases）,催化
7、氧化还原反应的酶，包括: 氧化酶类脱氢酶类过氧化氢酶过氧化物酶,（1）氧化酶类：催化底物脱氢，并氧化生成H2O或H2O2 。,2A2H+O2 2A+2H2O,A2H+O2 A+H2O2,（2）脱氢酶类：直接催化底物脱氢,A2H + B A + B2H,例：乳酸脱氢酶（EC 1.1.1.27，L-乳酸：NAD+氧化还原酶）,2转移酶类（transferases）,催化基团的转移,例：谷丙转氨酶（GPT） （EC 2.6.1.2，L-丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶）,3水解酶类（hydrolases）,AB + H2O AOH + BH,邻苯二酚氧化酶（EC 1.10.3.1，邻苯二酚：氧氧化酶）,
8、邻苯二酚,邻苯醌,例：,4裂合酶类（lyases）,从底物移去一个基团而形成双键或逆反应,AB A + B,例1：,例2：,5异构酶类（isomerase）,催化异构化反应,例：,6连接酶类（ligases, 也称synthetases合成酶类）,将两个小分子合成一个大分子，通常需要ATP供能。,例：,（连接酶）,（异构）,（裂合）,（水解）,二、酶活力,酶活力-酶催化一定化学反应的能力 酶活力的大小可以用一定条件下，催化某一化学反应的反应速度来表示。催化的反应速度越快，酶活力越高。,p.218,测酶活性时应注意：,酶活力的测定应测反应的初速度； 酶反应速度一般用单位时间产物的增加量表示； 保
9、持反应温度、溶液pH、离子强度I、底物浓度等条件的恒定； 应使SE。,产 物 浓 度P,(t),酶活力单位：,U-一定条件下，一定时间内，将一定量的底物转化为产物所需要的酶量； IU-特定条件下，每分钟，将1mol的底物或底物中的有关基团转化为产物所需要的酶量； Kat-最适条件下，每秒钟，将1mol的底物或底物中的有关基团转化为产物所需要的酶量；,1 Kat = 1 mol/s = 60 mol/min = 6 107 mol/min = 6 107 IU,1 IU = 1 mol/min = 1/60 mol/s= 1/60 Kat = 16.67 nKat,习惯上沿用的单位如 :,乳酸脱
10、氢酶的活力可用丙酮酸的增加量表示，也可用340nm光吸收的增加量来表示。,酶的比活力（U/mg）：每mg酶蛋白所具有的酶活力。,比活力反映酶的纯度。,比活力 =,蛋白质浓度（mg/ml）,酶活力（U/ml）,转换数(TN or Kcat)：在最适底物浓度时，每分钟或每秒钟每分子酶转换底物的分子数。,酶活力的测定方法,（1）化学反应法,不同时间取样、终止反应、显色反应、检测产物的增加量。,适应面广；,设备简单；,优点：,（2）动力学法,要求底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。,简便、迅速、准确。,一个样品可多次测定，有利于动力学研究。,可检测到10-9mol/L水平的变化。,优点：,分光光度
11、法（spectrophotometry）,不终止反应，连续测定底物或产物的变化量。,荧光法（fluorometry）,要求酶反应的底物或产物有荧光变化。,主要的优点：灵敏度很高，可以检测10-12mol/L的样品。,酶蛋白分子中的Tyr、Trp、Phe残基以及一些辅酶、辅基，如NADH NADPH、FMN、FAD等都能发出荧光。,（3）酶偶联分析法(enzyme coupling assay),第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个酶系统在一起反应。,P1无光吸收或荧光变化，偶联后, P2有光吸收或荧光变化。,（4）电化学法（electrochemical method）,有离子选择性电极法、
12、微电子电位法、电流法等。,离子选择性电极法要求在酶反应中必须伴随有离子浓度的变化或气体的变化（如O2、CO2、NH3等）。,酶的分离纯化,低温操作；,避免过酸过碱、剧烈搅拌、有机溶剂等；,加保护剂；,跟踪测活、计算比活力和总活力；,三、酶促反应动力学,酶促反应动力学研究酶促反应的反应速度以及各种因素对反应速度的影响,影响酶促反应速度的因素,底物浓度； 酶浓度； PH； 温度； 激活剂； 抑制剂；,1底物浓度对酶反应速度的影响,1903年 Henri 蔗糖酶水解蔗糖,中间复合物假说（Henri 和 Wurtz提出）：,P的生成速度即反应速率v取决于ES；S很低时，s增加，ES增加，v增加，一级反
13、应；S很高时，s增加，ES不再增加，v不变，零级反应；实验支持。,米氏方程的提出：,1913年，Michaelis 和Menten 推出公式：,米氏方程 Vmax：最大反应速度 Km: 米氏常数,平衡法推导：,所谓恒态是指反应进行一定时间后，ES的生成速度和ES的分解速度相等，亦即ES的净生成速度为零，此时ES的浓度不再改变，达到恒态，也称稳态。,恒态法推导：,米氏常数,米氏常数的物理意义是：酶反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。 Km是酶的特征常数。不同的酶有不同的Km值。 Km与酶的性质有关，与酶的浓度无关。 Km与酶的底物有关。同一种酶对不同的底物有不同的Km值。其中Km最小的底物
14、为酶的最适底物。 Km与反应的条件有关，只有在一定的反应条件（pH, T）下，Km才是常数。 Km可以近似地反映酶与底物的亲和力（？）。Km越大，酶与底物的亲和力越小。,Km的求法：,v s 作图,1/v 1/s 双倒数作图法（Lineweaver-Burk作图法）,（3）v 对 作图（Eadie-Hofstee法）,（4） S/v 对S作图（Hanes-Woolf法）,（5）直接线性作图法（Eisenthal和Cornish-Bowden法）,米氏方程的讨论：,米氏方程与一级反应、零级反应,米氏方程是双曲线方程,酶被底物饱和的百分数,2. 酶浓度对酶反应速度的影响,sE时，E被饱和，v =
15、k E,3. pH对酶反应速度的影响,最适pH,酶的最适pH不是一个常数，受到底物的种类、浓度，缓冲液的种类、浓度，酶的纯度，温度，反应时间等等因素的影响。,例: 碱性磷酸酶催化磷酸苯酯水解时,s为2.5x10-5 M，最适pH为 8.3s为2.5x10-2 M，最适pH为10.0,不同的酶有不同最适pH， 动物体内的酶多数在68之间，例外：胃蛋白酶：pH=1.5-2，精氨酸酶：pH=9.7 植物、微生物体内的酶最适pH一般为4.56.5。,大多数酶的pH酶活性曲线为钟罩形，例外：胃蛋白酶：右半支，胆碱酯酶：左半支，木瓜蛋白酶：直线。,pH影响酶活力的原因： pH影响底物、酶、中间产物的解离状
16、态；过酸过碱破坏酶的空间结构，导致酶的活性降低乃至失活。,4. 温度对酶反应速度的影响,表现在两个方面： 温度升高，反应速度加快；（反应的温度系数：Q10） 温度升高，使酶蛋白变性而失活； 最适温度,动物细胞内的酶最适温度在3540C，植物细胞内的酶最适温度在4050C，微生物细胞内的酶最适温度差别很大，如TaqDNA聚合酶最适温度为70C。 最适温度不是酶的特征常数，受到底物种类、反应时间、pH、离子强度等因素的影响。一般而言，反应时间长则最适温度低。,5. 激活剂对酶反应速度的影响,凡能提高酶活性的物质都称为激活剂 包括： 1.无机离子：金属离子（Na+,K+,Ca2+,Mg2+.）无机阴
17、离子（Cl-, CN-,I-.）氢离子 2.有机化合物：Cys, GSH, EDTA. 3.具有蛋白质性质的大分子，如酶原可被一些蛋白酶激活，蛋白酶可看作为激活剂。,激活剂作用的特点： 激活剂对酶的作用具有一定的选择性； 有的离子之间可以相互取代； 有的离子之间相互拮抗； 激活剂的浓度可能影响其作用；,6. 抑制剂对酶反应速度的影响,由于某种物质使酶分子上的某些必须基团或者活性中心发生变化，使酶活性降低或者丧失，称为抑制作用。 使酶蛋白变性而引起酶活力降低或者丧失，称为失活作用，或钝化作用。,抑制作用的类型： 不可逆抑制作用： 可逆抑制作用：,不可逆抑制作用,E + I EI 共价键结合；如：
18、有机磷化合物对蛋白酶、酯酶的抑制作用；,或,有机磷化合物结构通式,R1、R2 : 烷基 ; X: -F, -CN等,一些有机磷杀虫剂，如1605、敌百虫、敌敌畏、乐果等。,有机汞、有机砷化合物；（巯基酶） 烷化剂；（巯基酶） 硫化物、氰化物、CO等；（金属酶） 重金属离子；,其它常见不可逆抑制剂,可逆抑制作用,非共价键；,可逆抑制作用的分类,竞争性抑制作用competitive inhibition； 非竞争性抑制作用noncompetitive inhibition； 反竞争性抑制作用uncompetitive inhibition；,（1）竞争性抑制作用（competitive inhib
19、ition）,例: 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用,米氏方程：,V-s 曲线：,当 I 0时，方程还原成米氏方程。, I 时，,双倒数作图,当S 很大,抑制程度:,（2）非竞争性抑制作用（noncompetitive inhibition）,E+S ES ESI,E+I EI ESI,当I0,I,抑制程度跟S无关,（3）反竞争性抑制作用（uncompetitive inhibition）,抑制程度与I、S都有关,影响酶催化效率的因素：,邻近效应和轨道定向； 底物形变和诱导契合； 酸碱共同催化； 共价催化； 酶活性中心的疏水效应；,邻近效应：指两个反应的分子，它们反应的基团需 要互相靠近，才能反
20、应。,定向效应: 指酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确定向。,张力效应和底物形变（strain and distortion）,酸碱催化（acid-base catalysis）,酚,吡啶,-羟基吡啶,酶活性中心的疏水环境效应,带电基团之间的静电作用在非极性环境中比在极性环境中显著增高。,四、调节酶,别构酶/变构酶 共价调节酶,酶的活性中心/活性部位：,酶分子中与酶活力直接相关的区域称为酶的活性部位。 一般只有少数氨基酸残基参与组成； 在一级结构上可能相距很远，但在空间结构上相互靠近； 分为结合部位（决定专一性）和催化部位（决定催化反应的性质）；,活性中心与必需基团,必需基团是酶表现催化活
21、性所必需的部分； 包括活性中心以及维持酶的空间结构所必需的基团。,别 构 酶,酶的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后，酶构象发生改变，导致酶活性发生改变，这类酶称为别构酶，这种作用称为别构效应。调节物/效应物正调节物，负调节物 正别构、负别构 同促效应、异促效应,1.米氏酶 2.正协同效应别构酶 3.负协同效应别构酶,正协同效应使酶的反应速度对底物浓度的变化极为敏感； 负协同效应使酶的反应速度对底物浓度的变化不敏感；,区分标准：酶与底物结合达到90%饱和度时的底物浓度 Rs=-酶与底物结合达到10%饱和度时的底物浓度Rs=81：米氏酶 Rs81：负协同效应别构酶,目前常使用Hill系数区
22、分米氏酶与别构酶,Hill方程 :,将Hill方程中的有关参数换成别构酶中的有关参数,n为Hill系数，米氏酶Hill系数 n=1,正协同效应的别构酶 n1,负协同效应的别构酶 n1,正协同效应别构酶大肠杆菌的天冬氨酸转甲酰酶 ATCase：C6R6 : 2 C3 +3 R2 ATP：正调节物CTP：负调节物,ATCase活性调节的机理,有催化活性的构象,无催化活性的构象,负协同效应别构酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶：4亚基,别构酶调节酶活性的机理,1、对称或协同模型（symmetry or concertedmodel,也称齐变模型、MWC模型）,1965年由Monod、Wyman和Changeu
23、x提出。,该模型的要点 :,2、序变模型（sequential model，也称KNF模型）,1966年由Koshland、Nemethy和Filmer提出。,该模型的要点 :,共价调节酶,常见的有: 磷酸化/脱磷酸化腺苷酰化/脱腺苷酰化乙酰化/脱乙酰化尿苷酰化/脱尿苷酰化甲基化/脱甲基化S-S/SH相互转变,同 工 酶,乳酸脱氢酶（LDH）,固定化酶（immobilized enzyme）,固定化酶是将水溶性的酶连接到固相载体上， 使它以固相的状态作用于底物，因此也称固相酶。,固定化酶的优点,固定化酶的理化性质,固定化酶的制备, 吸附法, 偶联法, 交联法, 包埋法,习题： 1.称取25mg
24、蛋白酶制剂配成25ml溶液，取2ml溶液测得含蛋白氮0.2mg， 另取0.1ml溶液测酶活力，结果每小时可以水解酪蛋白产生1500ug酪氨酸，假定1个酶活力单位定义为每分钟产生1ug酪氨酸的酶量，请计算： (1)酶溶液的蛋白浓度及比活 (2)每克酶制剂的总蛋白含量及总活力。2.甘油醛-3-磷酸脱氢酶，分子量4万，由4个相同亚基组成，每个亚基上有一个活性位点，在最适条件下，5g纯酶制品每分钟可以催化2.8mol甘油醛-3-磷酸转化为甘油酸-3-磷酸。请计算酶的比活力。,3.在不同底物浓度的反应体系中，分别测有无抑制剂存在时的v，数据如下：S 无I 有I(2.210-4mol/L) mol/L (
25、10-4) v(mol/min) v(mol/min)1.0 28 171.5 36 232.0 43 295.0 65 507.5 74 61 求有无抑制剂存在时的Vmax和Km（Km），并判断这种抑制剂是什么类型的抑制剂。,4. 在一组10ml的反应体系中，加入不同浓度的底物。分别测反应初速度，得数据如下： Smol/L v(mol/min) 5010-7 0.0096 5010-6 0.071 5010-5 0.20 5010-4 0.25 5010-3 0.25 5010-2 0.25 不作图计算： (1)V 和Km。 (2)计算S=1.010-6 mol/L和S=1.010-1 mol/L 时的v。 (3)计算S=2.010-3 mol/L 或S=2.010-6 mol/L时最初5分钟内的产物总量。 (4)假如每一个反应体系中酶浓度增加至4倍时，Km ，Vmax 是多少？ 当S=5.010-5 mol/L时，v是多少？,
