1、第四章 基因操作 Gene manipulation,第一节 碱基互补的能力一、DNA的热变性1GC含量高的DNA具有较高的熔解温度，可以根据熔解温度的不同将GC含量不同的DNA分子分开，并可推测DNA分子中GC的相对含量。2根据熔解温度的差别在DNA分子中作基因定位和分离基因。组蛋白是与核DNA结合的碱性蛋白，富含精氨酸，其编码区相对富含GC对。, 海胆组蛋白基因在较底温度时（61）的变性电镜图，每种组蛋白基因被一个富含AT对区域间隔开。用S1核酸酶处理，消除单链。,H1,H2A,H3,H2B,H4,二、互补单链的复性利用互补单链复性的特点可以确定基因缺失的位置和大小：一个缺失突变体的DNA
2、和一个野生型的DNA一起复性后就可确定缺失区。,a b c d e,a, b, c, d, e,a b d e,a, b, d, e,a b c d e,a, b, c, d, e,a b d e,a, b, d, e,a b,c,d e,a, b, d, e,Heat,Mix and cool,三、染色体上DNA序列的定位用特异性RNA或DNA作探针与染色体上相应的DNA互补区域作杂交，从而确定该特异性基因的位置称染色体原位杂交（in situ hybridization of chromosome）。,In situ hybridization of human metaphase chr
3、omosomes using fluorescent technique (FISH),第二节 限制性内切酶,一、宿主限制现象,X,X,A,B,X-A,X-B,A,B,B,X-A,X-B,X-B,100%,100%,0.002%,100%,Phage,Infect,Bacteria,从两个不同菌株A和B来的噬菌体X具有不同的感染能力,B,X-B,100%,100%,很差,无法分离到能感染A细菌的X-B来的噬菌体,用很少一些感染力差的,结果说明：噬菌体的宿主范围取决于它所来源的细菌菌株，而不是噬菌体的基因型；宿主的基因型对噬菌体有一种修饰作用，但并不改变噬菌体DNA的序列。细菌的基因型决定该细菌
4、对各种噬菌体感染的敏感性，一种噬菌体的基因型决定它所能感染细菌的范围，它们之间具有密切的依赖和限止关系。在不同基因型的细菌中生长的噬菌体其具有不同的感染能力,二、DNA的修饰 是什么限制了XB噬菌体在菌株A中的繁殖呢？是由于宿主的一种核酸酶的作用，它能将噬菌体DNA切成许多无感染力的片段，宿主细胞具有破坏其陌生DNA的防卫系统。 怎样保护宿主自身的DNA和感染性XA噬菌体DNA免受宿主核酸酶的攻击？有一种酶能在特定序列上修饰特异性碱基，但是并不改变这些碱基的编码性质。如在胞嘧啶和腺嘌呤上增加一个甲基后就能保护DNA免受核酸酶的攻击，该过程称甲基化作用（methylation）。,在宿主限制现象
5、中有两个相互的过程：（1）由于宿主核酸酶的作用破坏了侵入的噬菌体DNA，从而限制了噬菌体的繁殖； （2）噬菌体DNA修饰免除了限制酶的作用。 Bacterium A has the capacity to modify DNA whereas B does not,三、限制酶的特异性1970年，Hamilton Smith从流感嗜血杆菌d株分离到能识别特定核苷酸序列，切点专一的限制酶HindII5GTPyPuAC33CAPuPyTG5Smith进一步证明宿主诱导的甲基化作用保护了具有同样序列的DNA免受HindII的切割： m5GTPyPuAC33CAPuPyTG5m ,*,*,Py：pyri
6、midine Pu：purine, E.coli的R质粒的一个基因产生的限制酶EcoRI，它对SV40病毒的环状DNA分子上只有一个切点。5GAATTC33CTTAAG5上述序列是旋转对称的。由于切点是错开的，因此使SV40的环状分子切开成具有粘性末端（sticky ends）的线状分子。 上述序列中腺嘌呤的甲基化也能保护DNA免受EcoRI的切割。,m,m, 回文序列palindrome5 G A A T T C 33 C T T A A G 5 EcoRI切点的两条链中的序列从相反方向阅读是一样的，称为回文序列palindrome。从正向和反向阅读是同一句子：ABLE WAS I ERE
7、I SAW ELBA,几种限制酶的名称和识别序列,四、限制酶作图 1在DNA分子上确定限制酶切点的相对顺序是一种重要的染色体作图法。从图上任何两个切点之间的距离可估计出核苷酸的数目。2方法要点：特定来源的DNA经不同的酶消化后，样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，可得到限制位点的图谱。,1 2 3 4 5,5,3,3, 5,酶 1,酶 2,1 2 3 4 5,32P,32P,酶 1,酶 2,Digestion,1 2,3 4,5,32P,1,2 3,4 5,32P,32P,A,B,C,D,E,F,(a),(b),32P,1 2,3 4,5,1,2,3,4,5,酶 2,A,B,C,1,2 3,4 5,
8、D,E,F,1,2,4,5,酶 1,(a),(b),根据重叠的亚片段排列原先片段的顺序,亚片段,位于原先片段,1 2 3 4 5,A D A E B E B F C F,(c),3,根据重叠的亚片段排列原先片段的顺序，可以得到一个DNA的酶切图谱。,1,1 2,2 3,3 4,4 5,5,D,A,E,B,F,C,1 2 3 4 5,2 1 2 1,酶切位点,2 1 2 1,酶切图谱,练习题：从某一生物的基因组Bam HI文库中获得了长3.0kb的片断,如用EcoRI消化该片断获得1.7kb、0.9kb和0.4kb三种片断;如用Hind 消化获得1.6kb和1.4kb片断;如用上述两酶混合消化获
9、得1.2kb、0.9kb、0.5kb合0.4kb四种片断。根据上述结果绘制限制性图谱。要求标出EcoRI、Hind和BamHI的位点和它们间的距离。,第三节 重组DNA,在细菌细胞中选择性地扩增特定DNA片段的过程称分子克隆（molecular cloning）。,重组DNA技术的基本步骤,（1）获得目的基因，一般是有重要生物学功能的外源基因。 （2）在限制性内切酶和连接酶的作用下，将目的基因与克隆载体相连接，组成一个新的重组DNA分子（recombinant DNA （3）将重组DNA分子引入受体细胞，并在细胞中进行DNA复制，最常用的受体细胞为大肠杆菌。 （4）对转化子（含有重组分子的受体
10、细胞）进行筛选和鉴定，以确认含有外源基因。 大量培养细胞可获得目的基因的大量拷贝，或基因表达的产物等。,一般意义上的重组DNA技术专指在细菌细胞中特异性地扩增特定DNA片段的分子克隆技术，广义上的重组DNA技术还延伸到整个基因工程的应用领域。,重组DNA技术的基本步骤,外源DNA,载体,重组E.coli,目的基因的制备,构建重组DNA分子，首先要获得有用的目的基因片段，最常用的方法有三种： （1）直接从一生物中提取基因组DNA，并构建该基因组的文库（gene library）再从中调出目的基因的克隆。 （2）以mRNA为模板反转录合成互补的DNA，称cDNA，并构建cDNA克隆。 （3）采用聚
11、合酶链反应（PCR）特异性地扩增某一目的基因的片段。,细胞内总DNA的提取和基因文库的构建,各种生物的特定组织（如血液、肝脏、植物组织、细菌细胞等）都含有大分子量的DNA。由于目的基因位于整个基因组DNA中，难以检出和分离，可以先将基因组DNA用内切酶切成较小的片段，再将它们分别与载体相连，并转入细菌细胞中进行繁殖和扩增，再对各个不同的克隆作出检定。 非选择性地在细菌细胞中克隆某一生物的随机DNA片段的过程称鸟枪法，全部克隆集合体称某一生物的基因文库。组成一个生物的基因文库的全部重组质粒或重组噬菌体中的目的基因就代表了一个生物的整个基因组。,一、直接产生粘性末端用于组成一个新的重组DNA分子（
12、recombinant DNA） 16-2,二、加尾连接（Tailing）1同聚物加尾 末端转移酶（terminal transferase）能催化DNA的3末端加上核苷酸尾，如将dA和dT加到不同的DNA末端，就可以连接成重组质粒，polyG和polyC也可用相同方法加尾。 同聚物加尾连接的优点：加尾后DNA片段自身不会环化，可提高异源DNA重组率。缺点：加入的polyA和polyT可能影响基因表达；外源基因克隆扩增后不能用限制酶重新从重组质粒中切出来。,TTAA,AATT,5,3,3,5,5,3,3,5,AAA,AAAA,5,3,5,3,AAA,AAAA,TT TTT,TT TT,AAAA
13、,AAAAA,T TT TT,TT TT,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,5,3,E coRI,外切酶,末端转移酶,dATP,shear,外切酶,末端转移酶,dTTP,TTTT,TTTTT,Plasmid DNA,Drosophila DNA,DNA polymerase,DNA ligase,末端转移酶（terminal transferase）能催化DNA的3末端加上核苷酸尾，如将dA和dT加到不同的DNA末端，就可以连接成重组质粒,2人工接头的应用 人工接头是一个合成的含有特定限制酶识别顺序的核苷酸片段。EcoRIC C G A A T T C G G EcoRIG G C T
14、T A A G C C 人工接头EcoRI,T4DAN 连接酶,人工接头,EcoRI,外源DNA,粘性末端用于连接载体,人工接头的应用,四、载体Vectors 能使克隆的片段不断复制的一类DNA分子称载体，应具备以下特点： （1）分子量小，核苷酸序列清楚，具有一些单一酶切位点或人工插入的多克隆位点区。 （2）分子中具有一个复制起始点，能使载体自身和插入的外源DNA共同复制。（3）具有易于筛选重组分子的标志，如抗药性。(4) 比较容易从宿主细胞中回收,1质粒：双链环状DNA分子，能经转化导入E.celi中 优点：能使宿主细胞产生抗性，便于选择质粒，在细胞中的拷贝数多。,A color-enhan
15、ced electron mincrograph of circular plasmid molecules isolated from the bacterium E.coli.,.The plasmid pUC18 offers several advantages as a vactor for cloning,Cloning with a plasmid vector. 16-9,利用Lac Z基因的插入失活筛选重组子,许多载体的多克隆位点区插入在Lac Z基因区中。Lac Z基因编码-半乳糖苷酶的一个亚基，它可以使携带载体的细菌在含有X-gal（能被-半乳糖苷酶水解的底物）的培养界上
16、形成蓝色的菌落。当外源基因插入到多克隆位点区后就阻断了Lac Z基因的编码区，使Lac Z基因失去了功能，因此，凡是插入了外源基因的重组质粒进入宿主细胞后，这些细胞就不能利用X-gal，结果在培养基上形成白色的菌落。挑选出白色菌落可作进一步鉴定。,A Petri plate showing the growth of bacterial cells after uptake of recombinant plasmids. 16-6,菌落原位杂交筛选和鉴定克隆的基因,根据重组质粒中的目的基因的序列，合成一段与之互补的DNA序列，并使其标记上放射性同位素，该段DNA称为探针。再用探针与菌落中的D
17、NA进行杂交，可从许多未知的菌落中挑选出克隆有目的基因的菌落。,2噬菌体它的头部通常能包装进45kb长的DNA分子，基因组中间部分是裂解性生长的非必需区，因此在其区域内转换插入大的外源DNA片段可以不影响其复制功能。,3单链病毒 在感染E.coli过程中，感染性单链能转变为双链的复制型。分离这种复制型的双链可用作克隆的载体。这种噬菌体用作克隆的优点：在重新感染合适的宿主时，它产生的噬菌体颗粒是单链DNA，为DNA序列分析提供方便。,4表达载体Expression Vectors 具有合适的转录和转译起始信号，外源基因插入合适的区域后能够表达的载体。某些载体质粒既具有E.coli的复制起始区，又
18、具有动物病毒SV40的复制起点，这样的质粒既可在E.coli中复制，又可在培养的动物细胞中复制，应此称为穿梭载体。Shuttle Vectors,第四节 重组DNA方法学,一、克隆战略1无选择地从一个限制酶切的混合物中克隆全部片段，然后再筛选所需的目的基因。非选择性地在细菌中克隆一个高等生物的随机DNA片段的方法称为鸟枪法（Shotgunning），全部克隆的集合体称为一个基因文库（gene bank, or gene library）。组成一个基因文库的全部重组质粒或全部重组噬菌体代表了一个生物整个基因组。2 用一目的基因的一个探针从整个DNA酶切片段的集合体中选出合适的酶切片段，然后再克隆
19、特定的片段。,组成一个基因文库的全部重组质粒或全部重组噬菌体代表了一个生物整个基因组。,二、鉴定克隆的基因 1用特定的内切酶消化重组质粒，电泳比较切出片段的大小。,2Southern Blotting酶切和电泳只能对重组克隆作出初步鉴定，可得知克隆片段的大小但尚难确定克隆片段是否目的基因。Southern发明了一种对电泳凝胶中的DNA作分子杂交鉴定的方法。该方法可用于重组质粒鉴定，转基因生物中外源基因的插入位置，遗传病的分子诊断等。 单链DNA能结合到硝酸纤维滤膜上，酶切物经电泳后，琼脂糖胶作变性处理，然后将DNA吸印到膜上，用32P标记的DNA或RNA探针与膜上的DNA作杂交，自显影后可显示
20、出目的基因的位置和大小。,The Southern blotting technique,southern blot after hybridization, exposure, and development. The bands show DNA fragments complementary to the nucleotide sequence of the probe.,3用cDNA克隆作探针，从基因文库中筛选目的基因克隆。用反转译酶从mRNA制备cDNA，全部cDNA片段与质粒载体相连，转化E.coli得到的全部克隆称为cDNA文库。* 一个基因的cDNA克隆和genomic克隆可能
21、在大小上有很大区别，为什么？ 4直接分析克隆基因表达的蛋白,在生物的不同器官和组织，或在细胞的不同的分化阶段会有某些特定基因的表达，此时细胞中的特定基因会特异性转录成特定蛋白的mRNA，因此可用反转录方法获得该基因的cDNA。 用反转录酶从mRNA合成cDNA；全部cDNA片段与载体相连并转入细菌细胞获得的全部克隆称cDNA文库，再从cDNA文库中调出目的cDNA克隆。,思考题：假定人生长激素基因的cDNA(1kb)已经插入在某一载体的BamHI和EcoRI的酶切位点中，该克隆大小为5kb。例举两种鉴定该基因的具体方法，要求写出实验步骤，并且用图表示鉴定结果。,三，克隆基因的定点诱变,意义,：
22、基因的功能通常是通过其突变体来认识其作用的。在,重组,DNA,技术中常需研究,DNA,序列上特定部位的功能，或改变,基因编码区个别氨基酸的密码子以提高该基因表达蛋白质活性,等。,定义:特异性地改变某一基因的方法称 定点诱变 site-directed mutagenesis,克隆基因的定点诱变,根据基因中欲改变位点的核苷酸序列设计一段引物，引物中含有突变的碱基。在聚合酶作用下，合成一条互补的含有突变基因的链，将杂合双链引入大肠杆菌细胞，经复制后会产生一个野生型和一个突变型基因的细胞，再用分子杂交法作鉴定。,思考：如何用分子杂交法筛选和鉴定一个野生型和一个突变型基因？,第五节 DNA序列分析,D
23、NA序列分析是最终了解基因结构和组成的重要工具,在人类基因组计划中测定人基因组的全部核苷酸序列是该计划的核心。1977年Sanger发明了以双脱氧核苷三磷酸（23ddNTPs）作为DNA合成终止剂的“末端终止法”，开创了基因核苷酸序列测定的先河，最早完成了174全部序列的测定。为此Sanger第二次获得诺贝尔奖。,发现了重叠基因,Sanger等最早对174病毒作DNA序列分析，该病毒基因组全长5400bp，共编码9种蛋白质，但根据该9种蛋白质分子量推算其编码区，明显超过病毒基因组5400bp长的核苷酸所能编码的容量。如何解开这个谜？Sanger回答了这个问题：在基因组中存在重叠基因！,重叠基因
24、,定义：在一种蛋白质的核苷酸编码序列中包含了另一种蛋白质的编码序列，所不同的是各自以不同的读码框转译。174病毒的重叠基因如下：,A,B,C,D,J,F,G,H,E,重叠基因概念与密码子的非重叠性,Sanger采用独创的序列分析方法对174病毒基因组作序列分析，提出了令世人惊讶的重叠基因概念，是对基因认识的重大发展。重叠基因是利用两种不同的读码框架编码两种不同的蛋白质，在每一读码框中密码子解读仍是不重叠的。如下图：,aa1 aa2 3 59 60 61 62 63 149 150 151 152 ,Sanger序列分析方法原理,采用单链DNA（或将含有外源基因的重组质粒DNA变性），在引物和D
25、NA聚合酶的作用下，在四组独立的反应中除加有4种dNTPs外（其中之一为同位素标记），再分别加入4种ddNTPs中的一种作为链延伸的终止剂，结果将在四组反应管中产生长度不等的4组寡核苷酸链，它们分别终止于被测链的每一个A、G、C或T。如在加有ddATP的反应管中产生的是一系列以A为结尾的寡核苷酸链；在加有ddGTP的反应管中形成的是以G为结尾一组寡核苷酸链等等，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜和放射自显影即可从放射自显影胶片上读出DNA序列。,O,Base,H H,O = P P P O,O O O,O O O,2、3ddNTP的结构，注意其3位置是一个H而不是OH，因此后续的脱氧核苷酸不能接到3
26、位上从而造成链的终止。,Sanger DNA,序列分析示意图,DNA sequencing gel showing the separation of fragmentsin the four sequencing reactions (one per lane).,In DNA sequencing using dideoxynucleotides labeled with fluorescent dyes, all four ddNTPs are added to the same tube, and during primer extension, all combinations of
27、 chains are produced. 16-20,Automated DNA sequencing using fluorescent dyes, one for each base.,思考题： 假定某一克隆基因的部分序列为5，TCACGTAAGT3，试根据Sanger序列分析方法原理画出测定上述序列的放射自显影示意图，并对示意图作必要的标注和解释。,第六节 基因工程,由基因工程方法产生的生物称为转基因生物，它一般是指由导入外源DNA的细胞发育而成的生物。,基因工程, 定义：根据分子生物学和遗传学的原理，将一种生物的遗传物质DNA转移到另一生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达出所需要的
28、产物。,一、利用微生物基因工程生产重组基因工程药物,利用基因工程技术不但能得到大量的具有特殊功能的基因。而且可以让这些特殊功能的基因生产出具有特殊功能的蛋白质药物，这是目前基因工程 领域中最活跃最有成果和极富商业价值的领域之一，究其原因：（1）蛋白质和多肽是基因表达的直接产物，可用重组DNA技术进行研究和生产。（2）具有生物活性的蛋白和多肽是珍稀而具有很高医疗价值的药物，用常规分离的方法很难制取。,目前有几十种基因工程药物，常用的有：干扰素、白细胞介素、乙肝疫苗、人胰岛素和人生长激素等。 人类最早的商业化基因工程药物是人胰岛素和人生长激素，于80年代初投放市场，用大肠杆菌来生产，是基因工程 发
29、展的里程碑。胰岛素是治疗糖尿病的重要药物，之前从猪或牛的胰腺中提取分离，含量少而且会有毒素。人生长激素是治疗侏儒症，青少年增高和促进创伤组织修复的药物，生长激素具有种属特异性，从动物脑组织来源的生长激素不能用于人类，之前只能从刚死亡的人大脑垂体中分离纯化，来源极有限；而且发现长期应用会对人类有毒副作用。,The method used to synthesize recombinant human insulin.,19-15,溴化氰,例子 大鼠肝脏F抗原蛋白基因在大肠杆菌中表达F蛋白定位在肝细胞浆中，正常人肝组织中的F蛋白含量是血清中1370倍，只有肝细胞被破坏时，F抗原才释放到血浆中，使血
30、清中F抗原含量升高，,F抗原用作肝病诊断，首先需获得纯的F抗原。目前国内外大多采用生化提取的方法从人肝脏组织中分离F抗原，由于难以得到F抗原纯品，给大量制备诊断试剂带来困难。利用原核（大肠杆菌）表达系统，成功表达了大鼠肝脏F抗原，表达产物经SDS-PAGE，Western-blot分析，分子量为43kD，同时具有F抗原的免疫学活性，可作为一种基因工程产品用于今后的免疫检测工作。,方法： 基因克隆。提取大鼠肝脏总RNA，对其进行反转录和PCR（RT-PCR）扩增出目的基因（F-antigens cDNA），然后将其与pET-15b载体进行连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)plyss，在含氨卞青
31、霉素和氯霉素的培养基上筛选转化子。将酶切结果正确的表达质粒命名为pET15b-F。,表达载体pET15b-F 构建示意图,F抗原表达经IPTG诱导后，含表达载体pET15b-F的表达菌株表达出一外源蛋白，该蛋白大小在43kD左右，与文献报道大鼠F蛋白大小一致。且在该表达系统中得到高表达，外源蛋白表达量约占全菌总蛋白的40%。,F抗原纯化与鉴定离心后所得包涵体蛋白经过初步纯化和溶解后，经过亲和层析柱（Ni2+-charged IDA His-bind column）纯化，得到一分子量约为43kD的单一蛋白带（Fig.A泳道8）。 表达产物的Western-blot鉴定结果显示：该表达蛋白可与豚鼠
32、抗人F 蛋白的抗血清发生特异性结合反应，在硝酸纤维素膜上呈现一条分子量为43kD的显色带（Fig.B）,SDS-PAGE and Western-blot of the expressed F Antigen (A) 1.Protein molecular weight standard; 2.pET15b-F induced by IPTG; 3.inclusion body of the lysate; 4.supernatant of the lysate; 5.pET15b-F non-induced by IPTG; 6.pET-15b induced by IPTG; 7.non-
33、plasmid induced by IPTG; 8.purified target protein (B) Western-blot of the purified target protein. Guinea pig polyclonal antiserum against human F antigen was used as primary antibody.,(A) 1 2 3 4 5 6 7 8 (B),二、用真核细胞表达和生产基因工程药物,虽然用大肠杆菌细胞表达基因工程药具有许多优点，如成本低等，但由于原核系统表达的真核基因蛋白有时缺乏生物活性，其原因由于原核生物缺乏合适的转译后
34、修饰机制。因此用真核细胞表达和生产基因工程药物已受到重视。 真核细胞反应器： 外源基因在合适的载体带动下转染进入体外培养的哺乳动物细胞，昆虫细胞或酵母细胞，通过大规模培养细胞表达外源基因。,几种重要的基因工程药物已可用真核细胞反应器完成,昆虫细胞杆状病毒表达系统(Insect cell and Baculovirus Expression System)是一种高效的真核细胞表达系统 杆状病毒因其病毒粒子呈棒状或杆状而得名。 苜蓿尺蠖核型多角体病毒(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV)作为杆状病毒-昆
35、虫细胞真核基因表达系统的载体被广泛应用。,1. 幼虫吞食了感染有多角体的食物,多角体在消化道的碱性环境下溶解，释放出病毒颗粒，2. 每个病毒颗粒的脂蛋白外被又与肠壁细胞的质膜相融合，最终将核壳体释放至胞质中，核壳体再将自己的DNA转入细胞核内。3. 在感染后12h采用出芽方式离开宿主细胞，在跨过宿主细胞的质膜时，以宿主的质膜形成自己的外被，形成表型为出芽型病毒粒子（budded virus, BV），,生活史,Polyhedrin Protein,Virion,Envolope,Nucleocapsid cross-section,Nucleocapsid Longitudinal-secti
36、on,Polyhedron envelope,DNA-蛋白复合体由39KD衣壳蛋白外被所包围，形成一个核衣壳，若干个核衣壳外面再包被一层脂蛋白外被就成为病毒颗粒。几个病毒颗粒聚集成一簇，嵌在晶状基质中成为一个多角体包含体。,多角体包含体的组成,杆状病毒基因表达的级联式时序调控杆状病毒的基因表达分为4个时期：极早期（immediate-early, ）、晚早期(delayed-early,)、晚期(late, )和极晚期(very late, )。通常，每一后续时期基因的表达水平都高于前一时期基因表达的水平，其中极晚期基因表达水平显著提高，这也是构建杆状病毒表达载体的基础。如Fig所示。,Fig
37、 Schematic representation of the four phases of baculovirus gene expression in vitro,多角体蛋白 P10蛋白,由于多角体蛋白基因及P10蛋白基因具有非常高效的启动子，同时由于这两个基因的产物不参与感染病毒颗粒的形成，可以从病毒基因组中去除而不会对病毒的复制及感染造成影响。由于这两个特点，使人们得以设计利用杆状病毒启动子在昆虫细胞中表达外源基因.,杆状病毒表达载体构建 由于AcMNPV基因组的巨大，不可能用单一的限制性酶来对它进行操作，所以目前使用的杆状病毒表达载体系统大多采用构建转移载体（transfer ve
38、ctor）的方法。,将带有外源基因的转移载体DNA和野生型病毒DNA共转染体外培养的昆虫细胞，使得转移载体与野生型病毒发生同源重组，外源基因取代多角体基因，如Fig所示。通过重组病毒空斑纯化得到能表达外源基因的重组病毒。,Transfer vecter,Pp,Cloned gene,Pt,5,3,Polyhedrin gene,AcMNPV DNA,Recombinant AcMNPV,Fig. 共转染发生同源重组获得重组病毒,野生型病毒感染的昆虫细胞由于存在多角体基因，空斑测定时产生有多角体的空斑（occ+）。重组后由于多角体蛋白基因已被外源基因所取代，只能产生无多角体的空斑（occ-）。在
39、光学显微镜下根据折光率的不同可区分这两种不同表型的空斑。由此经过几轮的空斑纯化即可获得多角体缺陷的重组病毒。用重组病毒感染宿主细胞，感染后期得到外源基因的高效表达。,与野生型病毒共转染培养的昆虫细胞用磷酸钙沉淀法将重组转移载体质粒pVL1393-hGH与野生型病毒AcMNPV DNA共转染贴壁培养状态良好的Sf9细胞，由于pVL1393多角体启动子两侧存在与多角体基因同源序列，可与野生型病毒基因发生同源重组，从而使人生长激素基因替代野生型病毒中的多角体蛋白基因，得到重组病毒rAcV-hGH 。,重组病毒的Southern 杂交鉴定，hGH cDNA整合进杆状病毒基因组的正确位置中,表达产物的S
40、DS-PAGE与Western-blot分析,三、植物基因工程,定义：将外源目的基因导入体外培养的植物组织或细胞，通过组织或细胞培养使之发育成完整的再生植株转基因植株。,1. 冠瘿瘤天然的植物基因工程,自然界某些植物受到农杆菌的侵染会形成肿瘤冠瘿瘤。其形成的机理是由于农杆菌中含有的一种诱发肿瘤的质粒所引起的，称为Ti质粒（tumor-inducing plasmid，简称Ti质粒）。Ti质粒上的一段DNA能转移到侵染的植物部位细胞中，并插入到植物染色体中，由于该片段（称T-DNA）上具有诱发肿瘤的基因，所以能诱发植物产生肿瘤。,T-DNA,Tumor production,Nopaline s
41、ynthesis,T-DNA transfer function,Nopaline utilization,Origin of replication,Ti plasmid,Ti质粒（胭脂碱型）简图,冠瘿瘤天然的植物基因工程,2. 农杆菌Ti质粒作为植物基因工程载体,科学家根据冠瘿瘤形成的分子机理，通过改建农杆菌Ti质粒，使Ti质粒中的致瘤基因失活，同时插入目的基因，使之成为基因工程载体。通过感染转化植物组织和细胞，并使之培养成完整的植株。,Cointegrate Ti-plasmid,Tobacco plant cell,Trasformed cell,Cultured cell,Plant
42、let,Transgenic tobacco plant,Cell of transgenic plant,植物基因工程 程序图,3. 抗除草剂基因工程(Gene transfer of glyphosate resistance)草甘膦在低浓度时非常有效，对人无毒，可被土壤中微生物分解。草甘膦能被植物细胞的叶绿体的酶（EPSP合成酶）所分解，该酶对细菌和植物中的氨基酸的合成很重要，没有这种酶的作用，植物就会干枯和死亡。从抗草甘膦的细菌中分离和克隆EPSP合成酶的基因和抗除草剂基因工程,抗除草剂基因工程示意图 首先从抗草甘膦的细菌中分离和克隆EPSP合成酶基因，再进行植物抗除草剂基因工程 Ge
43、ne transfer of glyphosate resistance,Tobacco leaves expressing the hepatitis B antigen. 转基因植物叶片表达乙肝病毒表面抗原。 叶片用抗乙肝病毒表面抗原的抗体处理的结果。,正常叶片,4. 具有易于长期保鲜的转基因西红柿的制作过程原理如下：,通常的西红柿不易保存保鲜，这是由于一种蛋白酶的催化成熟的结果。将这种酶的基因分离出来，再根据该基因序列结构合成它的互补基因，再将这种互补基因转入到西红柿植株中，它将会产生出一种与上述蛋白酶基因正常转录的mRNA相互补的mRNA（称反义RNA），并且与之结合成双链，使之不能正
44、常翻译成催化西红柿成熟的蛋白酶。未成熟的西红柿易于长期保存保鲜和运输。只需用乙烯处理后即可成熟供应市场。,转基因西红柿的途径,5植物细胞的转化方法 （1） 叶圆片共培养转化 （2） 单细胞水平上的转化在Kan培养基上选择转化的组织再生植株。 5转基因植株的遗传以孟德尔比例传递。 转基因植株的一对染色体,Kan,自交,1/4 Kans,1/2 Kanr,1/4Kanr,思考题：Kanr 能在转基因植株中以组成型的方式表达，如对转化植株的花药作培养所得花粉植株抗性和敏感性比例如何？转化植株自交或与野生型回交的结果如何？,四.转基因动物,1.定义:转基因动物是指以实验方法导入外源基因,并在其基因组内
45、稳定整合并能遗传给后代的一类动物.2.意义: (1).建立转基因动物模型以研究外源基因在整体动物中的表达调控规律; (2).改变动物基因型使其表型更符合人类需要; (3).可用转基因动物产生人类需要的生物活性物质.,转基因生物反应器,定义：将目的基因导入动物体内形成转基因生物，由于基因表达，可以从转基因动物的特定组织或器官（乳汁、血液等）获得目的基因产物。使转基因动物象一个活的发酵罐一样来生产目的基因的产物。采用上述方法获得的转基因羊，可从羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA（组织溶解酶原激活剂）。,转基因的方法: 按基因导入方式划分,建立转基因动物主要有：显微注射法,反转录病毒感染法胚胎干细胞
46、法. 显微注射与反转录病毒感染方法都是把DNA直接导入受精卵或在不同的发育阶段.,受精卵 四细胞胚胎 囊胚 原肠胚 转基因动物显微注射 反转录病毒感染DNA DNA,在受精卵不同发育阶段的转基因方法,转基因动物的应用 研究遗传疾病的基因治疗人类伦理道德一般不允许直接对人的受精卵进行基因操作，一般是将处理过的体细胞移植到患者体内。但这种操作具有一定的危险性，必须首先在动物体内进行试验。所以，通过培育缺陷性状得到矫正的动物(或细胞) 可以为这类疾病的基因治疗提供动物(或细胞)模型。,基因剔除技术,研究人类基因功能的重要手段是 基因敲除。 由于人和老鼠的基因非常接近，因此当怀疑人类基因图谱中的某一片段同某种疾病相关时，就将老鼠体内的这个基因去除掉，看它会长成什么样。如果没眼，那么被去除的基因就是决定长眼的基因。,基因敲除（gene knock out） 是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上将该基因去除，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。 基因敲除还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。,
