1、青岛农业大学毕业论文题 目：猪瘟和蓝耳病疫苗中牛病毒性腹泻病毒污染情况的检测与分析 姓 名： 南 76767 学 院： 动物科技学院 专 业： 动物医学专业 班 级： 1003 学 号： 20103637 指导教师： 韩先杰 2014 年 5 月 21 日目录中文摘要 IAbstractII引言21 材料与方法 .21.1 试验材料 .21.1.1 试验疫苗 .21.1.2 试验试剂 .21.1.3 试验主要仪器设 .21.2 试验方法 .31.2.1 RNA 的提取 .31.2.2 RT-PCR 检测 BVDV .31.2.3 巢式 PCR 扩增 .41.2.4 琼脂糖凝胶电泳 .41.2.
2、5 胶回收提纯 .41.2.6 回收产物连接 .51.2.7 转化反应 .51.2.8 阳性克隆筛选 .61.3 序列分析 .62 结果与分析 .72.1 PCR 扩增结果 .72.1.1 巢式 PCR 扩增结果 .72.1.2 菌液 PCR 结果 .82.2 测序结果 .92.3 序列分析 .112.3.1 进化树分析 .112.3.2 同源性比较 .123 讨论 .133.1 检测方法 .133.2 BVDV 的污染情况 .133.3 控制疫苗中的 BVDV 污染措施 .143.3.1 预防免疫 .143.3.2 注意制作工艺 .143.3.3 国家加强对疫苗的监控与净化 .144 小结
3、.14致谢15参考文献16I猪瘟和蓝耳病疫苗中牛病毒性腹泻病毒污染情况的检测与分析动物医学专业 南福龙指导教师 韩先杰摘要：为调查我国商品化猪瘟和蓝耳病疫苗中牛病毒性腹泻病毒污染情况，本文采集 179份蓝耳病疫苗和 105 份猪瘟活疫苗，用 RT-PCR 方法检测疫苗中的牛病毒性腹泻病毒，评估疫苗污染牛病毒性腹泻病毒的情况。结果表明，蓝耳病疫苗中检出 6 份阳性样品，总污染率为 3.6%；猪瘟疫苗中检出 3 份阳性样品，总污染率 2.9%，造成污染的病毒均为牛病毒性腹泻病毒 1 型。关键词：牛病毒性腹泻病毒；PCR ；猪瘟；猪蓝耳病；疫苗IIDetection and Analysis of
4、Bovine Viral Diarrhea Virus Pollution in Classical Swine Fever and Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome VaccinesStudent majoring in Animal Medicine Nan FulongTutor Han XianjieAbstract: To investigate the contamination situation of BVDV, 105 CSF vaccine samples and 179 PRRS vaccine samples w
5、ere collected. Then, RT-PCR was applied to detect BVDV and evaluate the condition of pollution in vaccines. The results showed 6 of the 179 PRRS vaccine samples were BVDV positive and the contamination rate was 3.6%. At the same time, 3 of the 105 CSF vaccine samples were BVDV positive and the conta
6、mination rate was 2.9%. All the detected BVDV were identified as BVDV type 1.Key words: Bovine Viral Diarrhea Virus; PCR; Classical Swine Fever; Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome; Vaccine1目前，我国猪群重大疫病的防控主要依赖疫苗免疫，如猪瘟、蓝耳病等。弱毒疫苗具有可诱导体液和细胞双重免疫、只接种一次即可起到良好的预防效果、持续时间长、不需佐剂等优点，猪群疫病商品化疫苗以弱毒疫苗为主。但
7、是，弱毒疫苗的使用可能导致如下问题：易受外源病毒污染、发生交叉感染、有毒力残留等。我国猪用弱毒疫苗中，屡有外源病毒污染情况，常见污染源为支原体和牛病毒性腹泻病毒，上述污染物导致疫苗使用效价降低，不仅起不到预防和控制传染病的功效，严重时甚至造成疾病的传播。牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）与猪瘟病毒(classical Swine fever virus，CSFV) 相似，都属于黄病毒科瘟病毒属。BVDV 可分为 1 型和 2 型，1 型又可分为 1a 和 1b 亚型，都会引起牛病毒性腹泻病，但不同毒株间致病性差异性较大 1。牛病毒性腹泻病毒自首
8、次被报道以来，在全世界很多畜牧业发达国家中流行 2，如：澳大利亚、德国等国家猪群中 BVDV抗体阳性率达 3-40%，荷兰达 15-20%3，我国范学政等人对 2008 年从 10 个生物制品厂 23 个批次的疫苗抽检样品进行检测，检测结果为牛病毒性腹泻病毒的污染率为 21.74%4。各种年龄的牛都可感染牛病毒性腹泻，以幼龄牛易感性最高，在垂直传播后，会产生病毒血症。以含 BVDV 的血清作为原料时，就会污染制备的生物制品 5。猪瘟细胞苗生产过程中会使用到牛睾丸细胞以及牛血清 6；蓝耳病疫苗（尤其是弱毒疫苗）生产工艺中在传代细胞培养中会使用到牛血清，如果血清材料含有 BVDV 病原或抗体，会使
9、猪瘟细胞苗和蓝耳病疫苗污染。疫苗被 BVDV 污染后，会对其免疫效果产生干扰。BVDV 抑制疫苗抗体的产生，同时刺激机体产生大量针对BVDV 的抗体，导致疫苗免疫失败，表现为被接种动物体内存在较高水平抗体却依然会爆发传染病，其多数为 BVDV 抗体 7。此外，猪在接种了受污染的疫苗后也可能感染 BVDV，产生类似于猪瘟的临床症状和病理变化，王新平等 8从疑似猪瘟病料中检出了 BVDV。近年，我国发现猪场出现不明原因的猪瘟和蓝耳病免疫失败现象，可能原因是疫苗受 BVDV 污染，导致免疫失效，母猪感染后还会出现交配困难、不孕、流产等现象 9。若不能及时监测出疫苗中BVDV 污染情况，会造成重大经济
10、损失甚至传染病的流行。因此，对猪瘟和蓝2耳病疫苗受 BVDV 污染情况的监测与分析十分有必要。目前，可用于检测疫苗中 BVDV 病原的方法主要有：牛肾细胞直接病变、免疫荧光技术（indirect immunofluorescence, IFA） 、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunoadsorbent assay, ELISA） 、病毒中和试验（Virus neutralization test, VNT） 、琼脂扩散试验、RT-PCR 等 10。BVDV 与 CSFV 基因组核苷酸同源性可达 60%，氨基酸同源性可达 85%11，血清学上可出现交叉反应 12。污染 BV
11、DV 的 CSFV 疫苗免疫后，采用血清学方法无法准确区分血清抗体是由 BVDV 感染产生的还是由 CSFV 弱毒疫苗产生的。 近年，分子生物学技术广泛应用于 BVDV 的病原诊断，具有敏感、特异、快速、灵活、操作简便的特点，并可用于各种组织、全血等样品检测。因此，本文拟采用 RT-PCR 方法对 CSFV 和 PRRS 弱毒疫苗污染 BVDV 情况进行检测与分析，对指导畜牧业生产中科学使用疫苗有重要的指导意义。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 试验疫苗由中国动物卫生与流行病学中心从全国各地猪场收集其使用的猪瘟细胞苗和蓝耳病弱毒疫苗，进行初检，选取怀疑为阳性的疫苗作为本试验用样品。1.
12、1.2 试验试剂RNA 提取试剂（如：Trizol、冷氯仿、异丙醇、75%酒精、DEPC 处理水等）、引物、感受态细胞、AMP 、IPTG、X-gal 等由中国动物卫生与流行病学中心提供，One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（一步 RT-PCR 试剂盒） 、Ex-Taq酶（MIX） 、DNA Marker2000、pGEM-T easy Vector 购自 Promega 公司，胶回收试剂盒购自 QIAGEN 公司， Quick Ligation Kit、连接酶 Buffer 购自 New England Biolabs 公司，DURED 染料购自泛博生物化
13、学有限公司。1.1.3 试验主要仪器设Sigma 3-18 离心机购自 Sigma 公司、BSC 1300-II-B2 生物安全柜购自新华医疗器械股份有限公司、LS-P96G PCR 仪购自 Labserv 公司、DYY-i2 电泳仪购自北京六一仪器厂、Bio-Rad 凝胶成像仪购自 Bio-Rad 公司、BG-gds VIEW 可见紫外分析仪购自北京百晶生物技术有限公司、细胞温箱购自上海福玛实验设备有限公司、SDC-6 恒温槽购自宁波新芝生物科技公司、HZQ-C 空气浴振荡器3购自东联电子技术开发有限公司。1.2 试验方法1.2.1 RNA 的提取(1) 取疫苗 250 uL 加入无 RNA
14、 酶的 EP 管中，加入 750 uL Trizol 混匀，后室温放置 5 min，间或震荡。(2) 加入-20保存的冷氯仿 250 uL 剧烈震荡混匀后置于 4冰箱 10 min。(3) 置于离心机中以 12000 r/min，4离心 15 min。(4) 取 500 uL 上清（宁可少也不要取到沉淀物）于 EP 管中，加等量（500 uL）异丙醇，轻轻颠倒混匀，于-80冰柜沉淀 30 min。(5) 将液体以 12000 r/min，4离心 10 min。(6) 弃去异丙醇，加入 75%酒精 1000 uL，混匀，于 4冰箱静置 5 min。(7) 将液体以 12000 r/min，4离心
15、 5 min。(8) 弃去酒精，晾干后用 30 uL DEPC 处理水溶解，于-20冰柜保存。1.2.2 RT-PCR 检测 BVDVNCBI 网站 GenBank 给出 6 对供参考的 BVDV 扩增引物序列，经过试验研究，套式引物效果最好 14因此本试验选用套式引物，对 NS5B 基因序列进行扩增，其中的引物为 P1、P2、P3、P4。P1：10485-10583 5-ATCTTTCACACATAGCCCAAC-3 P2：11244-11264 5-GAAGCCATCATCCCCACGACG-3提取出来的 RNA 用 P1、 P2 引物于 PCR 仪中进行一步 RT-PCR，反应体系如表
16、1。表 1 RT-PCR 的反应体系试剂 用量(uL)Primescript RT Enzyme MIX 1.02X One Step SYBR RT-PCR Buffer 12.5F(P1)R(P2)ddH2ORNA0.50.57.53.0反应程序为 50反应 30 min，94反应 2 min，94变性 30 s，55退火30 s， 72延伸 1 min，此三步为 30 个循环，后 72反应 10 min，最后 4保存。41.2.3 巢式 PCR 扩增P3：10477-10498 5-TGGAGATCTTTCACACAATAGC-3P4：10815-10836 5-GCTGTTTCACCC
17、AGTTATACAT-3用 RT-PCR 的产物为模板，利用引物 P3、P4 进行巢式 PCR 扩增，反应体系如表 2。表 2 巢式 PCR 扩增试剂 用量（uL）Ex-Taq 酶（MIX） 12.5F(P3) 0.5R(P4)ddH2ODNA0.510.51.0反应程序为 94反应 3 min，94变性 30 s，55 退火 30 s，72延伸 1 min， 此 3 步为 33 个循环，后 72反应 10 min，最后 4保存。1.2.4 琼脂糖凝胶电泳(1) 在管中加好琼脂糖至标度。(2) 将固体琼脂糖加至锥形瓶，加缓冲液（1:100） 。(3) 在瓶口套上一次性手套在微波炉中加热 3 m
18、in。(4) 取电泳板并在上面加上玻璃板，再插上梳子。(5) 取出锥形瓶加染色剂 5 uL（染色剂不稳定，加热之后再加防止分解） 。(6) 将琼脂倒入玻璃板上至半个梳子高度（不要倒出气泡） ，静置 15-20 min。(7) 加 DNAmarker 2000 5 uL 加入第一个或中间的孔。(8) 将扩增产物取 5 uL 加入平板孔中。(9) 将玻璃平板取出放入电泳池，对齐放平，盖好盖，调至 130 V，130 mA 启动，电泳 30 min。(10) 将胶取出孔朝上放入凝胶成像仪中，先开白光调整位置，后打开紫外光先自动曝光，等到一个合适的亮度后手动曝光，保存。1.2.5 胶回收提纯将凝胶成像
19、仪中呈现较亮的 360 bp 左右的片段的 PCR 未纯化产物送上海生工公司测序，有 3 个样品测序失败，需进行目的 DNA 的克隆转化。(1) 进行电泳后在凝胶成像仪中找到目的片段。5(2) 在切割仪中垫上一个一次性手套，放上凝胶，打开紫外灯，尽可能小的切下目的条带并分装到 EP 管中，并在天平中进行称重。(3) 使用 QIAGEN 公司的胶回收试剂盒，按重量的 3 倍体积加入 Buffer QG。(4) 将 EP 管装在漂浮板上在水浴温箱中 50水浴加热 10 min 左右，直至凝胶完全溶解。(5) 将液体移入涡旋管中，12000 r/min，22离心 1 min，弃掉滤液。(6) 加入
20、750 uL Buffer PE 洗液 12000 r/min，22离心 1 min，弃掉滤液。(7) 开着盖 12000 r/min， 22离心 1min，换一个 EP 管。(8) 加 Buffer EB 洗脱液 40 uL，室温静置 10 min，待充分反应后 12000 r/min， 22离心 1 min，弃掉涡旋管，保留 EP 管中液体。1.2.6 回收产物连接在冰水中融化 Vector 与 Quick Ligation Kit，将回收的 DNA 片段与 pGEM-T easy Vector 连接，163 h 后 4过夜，连接体系如表 3。表 3 连接体系试剂 用量(uL)Vector
21、 0.5DNA 2.5Quick Ligation KitBuffer0.53.51.2.7 转化反应 (1) 将-70中冷藏的 DH5 感受态细胞取出放入冰水中融化。(2) 将连接体系移进感受态细胞中，再将感受态细胞冰浴 20 min（充分吸附）。(3) 42热水浴 90 s（热击，打开离子通道） 。(4) 冰浴 2 min（关闭通道） 。(5) 加未加氨苄的 LB 培养基至总体积 1 mL。(6) 将 EP 管放入摇床中，37，180 r/min 培养 1 h。(7) 将 EP 管于 12000 r/min，22离心 2 min 后弃去上清，只保留 300 uL 沉淀液。(8) 用移液枪反
22、复吹打沉淀至混合均匀后每 300 uL 菌液加入 Amp 300 6uL、IPTG 60 uL、X-gal 60 uL，混合均匀。(9) 每个 LB 固体培养基加入 120 uL 混合液后，每个 EP 管可使用 6 个 LB固体培养基，用涂布棒将菌液涂均匀后晾干。(10) 待 LB 固体培养基干燥后放入培养箱中 37培养 12 h。1.2.8 阳性克隆筛选(1) 将培养过后的 LB 固体培养平板取出，对光观察，选取单个白色大型菌落，蓝色不予考虑。(2) 用接种针将菌落接至装有 2 mL 氨苄 LB 培养液的细菌培养管中。(3) 将细菌培养管于摇床中摇振培养 12 h。(4) 用 P3、P4 引
23、物进行菌液 PCR 扩增，反应体系与程序如表 3 于表 4（变性温度改为 95） 。(5) 将扩增的 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳。(6) 对电泳结果进行分析，选取出现 360 bp 左右明亮带的菌液加甘油（保存）并用封口条封口送上海生工去测序。1.3 序列分析将测序后的序列对照 ABI 峰图进行修正，再使用 NCBI 网站上的Nucleotide Blast 功能，将修改后的序列在其中比对，找到相近参考序列后到Genbank 查看详细资料，相近参考序列如表 4，NS5B 标准株序列如表 5，外参毒株如表 6。表 4 相近参考序列Genbank 基因型 来源AB078950AF078535AF268278AJ781045HQ174294 JN380088 JX297517JX419397KC695814KF835698M31182M96687U634791ncp111-NADL1b1b1b11b1b1-NADL1-Osloss1-CP7JapanNew YorkUSABelgiumUSAUSACanadaJapanUSAUSAUSAUSAGermany
