1、楚 雄 师 范 学 院本 科 生 毕 业 论 文题 目:火烧迹地厚皮香对三叶鬼针草、麻栎化感作用研究 专 业: 生物技术 学 号: 20091052124 系 (院): 化学与生命科学系 毕业论文(设计)诚信声明本人声明:所呈交的毕业论文(设计)是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果,论文中引用他人的文献、数据、图表、资料均已作明确标注,论文中的结论和成果为本人独立完成,真实可靠,不包含他人成果及已获得青岛农业大学或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。论文(设计)作者签名: 日期: 2013 年 3 月 1
2、0 日毕业论文(设计)版权使用授权书本毕业论文(设计)作者同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文(设计)的复印件和电子版,允许论文(设计)被查阅和借阅。本人授权青岛农业大学可以将本毕业论文(设计)全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本毕业论文(设计) 。本人离校后发表或使用该毕业论文(设计)或与该论文(设计)直接相关的学术论文或成果时,单位署名为青岛农业大学。论文(设计)作者签名: 日期: 2013 年 3 月 10 日指 导 教 师 签 名: 日期: 年 月 日楚雄师范学院本科论文(设计)3目录摘要 关键词 Abstract Key word
3、s 前 言 11 材料与方法 11.1 材料 11.2 方法 11.2.1 植株水浸液的的制备21.2.2 种子萌发及幼苗生长的测定21.2.3 脯氨酸含量的测定21.2.4 MDA 含量测定21.2.5 POD 活性的测定31.2.6 细胞形态的观察31.2.7 细胞形态的观察32 结果与分析 32.1 厚皮香叶浸提液对三叶鬼针草和麻栎种子萌发率的影响32.2 厚皮香叶浸提液对三叶鬼针草麻栎幼苗的株高影响42.3 厚皮香叶浸提液对三叶鬼针草和麻栎幼苗根长影响42.4 厚皮香叶水浸液对三叶鬼针草植株脯氨酸含量影响52.5 厚皮香水浸液浓度对三叶鬼针草和麻栎 MDA 影响52.6 厚皮香水浸液浓
4、度对三叶鬼针草和麻栎 POD 影响62.7 三叶鬼针草和麻栎细胞显微形态观察63 结论与讨论 8楚雄师范学院本科论文(设计)4参考文献 9附录 10致谢 32楚雄师范学院本科论文(设计)I火烧迹地厚皮香对三叶鬼针草、麻栎化感作用研究摘要:为探究火烧迹地优势物种的化感作用机理,以火烧迹地厚皮香(Ternstroemia gymnanthera (Wight et Arn.)Sprague) 、 麻栎(Quercus acutissima Carruth) 、三叶鬼针草(Biden pilosa L.)为材料。以厚皮香叶为供体,麻栎和三叶鬼针草为受体,以厚皮香叶水浸液来研究其对种子萌发作用机理。设
5、置 5 个浓度梯度的水浸液以及各 3 组平行组。比较种子萌发率、苗高和根长、茎尖和根尖细胞显微观察,幼苗相关酶活性及含量的测定:包括过氧化物酶(POD)、丙二醛(MDA) 、脯氨酸含量的测定。结果表明:厚皮香叶片浸提液能不同程度地降低了三叶鬼针草和麻栎种子发芽率、苗高和根长;尤其对三叶鬼针草的种子萌发和幼苗生长抑制作用显著;高浓度时抑制效果显著,较低浓度时,有微弱促进作用;受体植物麻栎、厚皮香的脯氨酸、MDA 含量随浓度的升高表现为正相关,POD 值在 0.15 g/ml 时显著升高。受体植物根尖和茎尖细胞随着水浸液浓度的升高染色体数目呈下降趋势。表明厚皮香厚皮对三叶鬼针草和麻栎存在化感作用,
6、且对三叶鬼针草作用更为显著。关键词:火烧迹地;化感作用;厚皮香;三叶鬼针草;麻栎;萌发率;酶活性;染色体;楚雄师范学院本科论文(设计)IIBurned Ternstroemiaceae right Bidens, Quercus AllelopathyAbstract:To explore the burned area of dominant species, Allelopathy Mechanism to fire, thick skin fragrant trace (Ternstroemia gymnanthera (Wight et Arn.) Sprague), Quercus
7、acutissima (Quercus acutissima Carruth), Bidens pilosa (Biden pilosa L.) as material. With muskmelon leaf as the donor, Quercus acutissima and Bidens pilosa as receptor, with water immersion thick-skinned leaves to study the mechanism of seed germination. 5 the concentration gradient of the water ex
8、tract and the 3 groups of parallel group. Comparison of seed germination rate, seedling height and root length, shoot and root tip cell microscopic observation, determination of enzyme activity and content of seedlings: including peroxidase (POD), malondialdehyde (MDA), determination of proline cont
9、ent. The results show that: the thick leather leaf extract reduced the Bidens pilosa L. and Quercus acutissima seed germination rate, seedling height and root length; especially of Bidens pilosa Seeds Germination and seedlings growth significantly inhibited when the concentration is high; the inhibi
10、tory effect, low concentration, weak role; Quercus acutissima, receptor plants Ternstroemia proline, MDA content increased with concentration is positively related to performance, the POD values increased significantly at 0.15 g/ml. The receptor plant root and stem tip cells increased with the chrom
11、osome number of the concentration of the extracts showed a downward trend. That thick skin fragrant thick skin of Bidens pilosa and Quercus acutissima the allelopathic effects of Bidens pilosa L, and the effect is more significant.Key words:Burned area; allelopathy; Ternstroemia; Bidens pilosa; Quer
12、cus acutissima; germination rate; enzyme activity; chromosome;楚雄师范学院本科论文(设计)1火烧迹地厚皮香、三叶鬼针草、麻栎三者化感作用研究前言化感作用是森林生态系统中广泛存在的一种生态化学现象,是影响森林植物种群生长发育、结构功能乃至整个生态系统群落演替的重要因素 1。火灾能改变生态群落的结构,火烧强度是山地格局变化的重要引致因子,随着火烧强度的增加,森林水文调节能力降低幅度越大,湿地面积增加越显著,而未火烧区则变化很微弱。森林水文调节能力的变化则直接影响到山地水分来源 3;在林业科学研究及林业生产实践中,对于森林经营过程中出现的
13、连栽障碍、指导森林更新和建植、地力衰退、“土壤中毒” 、对农作物布局、果园经营等生产实践有广阔的开发和应用前景有重要的意义 4。麻栎(Quercus acutissima Carruth.)是栎属 (Quercus L) 落叶乔木。麻栎喜欢在光线充足,土壤深厚的山坡地上生长,形成麻栎树林或与松树组成混合树林。它分布于我国北起辽宁南到云南,西到西藏东部的大部分地区。具有木材材质坚硬、纹理美观、耐腐耐水湿等优良性状,是珍贵的优良建筑材和家具材用材树种 5。厚皮香 Ternstroemia gymnanthera (Wightet Arm.)Sprague.山茶科(Theaceae,Tea Fami
14、ly)厚皮香属常绿乔木,高达 15 米,枝条灰绿色,无毛。叶倒卵形至长圆形,长 37 厘米,宽 2 厚皮香(5 张)3 厘米,顶端钝圆或短尖,基部楔形,全缘,表面绿色,背面淡绿色,中脉在表面下陷,侧脉不明显;叶柄长 510 毫米。花淡黄色,花柄长 115 厘米,稍下垂。果实圆球形,呈浆果状,干燥,径约 15 厘米,萼片宿存。 花期 78 月。目前有学者对其扦插繁殖及光照强度对其幼苗生长、种子特性与扦插繁殖、厚皮香植物群落特征及繁殖特性、厚皮香造林技术等繁殖方面进行了大量而细致的研究 6-7。三叶鬼针草(Biden pilosa L .)为双子叶植物纲菊目菊科鬼针草属,一年生草本植物三叶鬼针草种
15、子在 1530恒温条件下萌发率均达到 80%以上,而且发芽快速而整齐,说明三叶鬼针草种子萌发的温度范围很宽,温度是影响三叶鬼针草种子萌发的重要生态因子。三叶鬼针草种子具有较好的初始萌发能力,无需经过休眠,且不需经过任何特殊处理就能快速而整齐的萌发。目前对三叶鬼针草研究较多主要是遮光对三叶鬼针草(Bidens pilosa)光合参数影响、环境保护方面对金属富集、干旱胁迫、水提物对其他植物种子萌发影响以及三叶鬼针草中黄酮甙对烟草花叶病毒的抑制作用等,但很少有学者研究三叶鬼针草和木本植物化感作用的研究 8-9。对厚皮香、三叶鬼针草、麻栎间的化感作用和机理研究有重要的意义,有助于我们更加合理地理解和解
16、释火灾后的优势物种现象,对森林的恢复重建工作提供一定的理论依据 10。 1材料与方法1.1 材料楚雄师范学院本科论文(设计)2于2012年10月在楚雄市西山公园(北纬N250156.58东经E101327.31海拔:1833.82米 )火烧迹地收集麻栎(Quercus acutissima Carruth.)、三叶鬼针草 (Biden pilosa L.)、厚皮香Ternstroemia gymnanthera (Wightet Arm.)Sprague.成熟饱满的种子备用并收集三种植物的叶片及根部制作水浸液备用。1.2 方法1.2.1 植株水浸液的的制备将采集来的厚皮香叶片、根在室温条件下阴
17、干并打磨成粉,分别取120 g、90 g、60 g、30 g、15 g,各加300 mL的蒸馏水恒温25泡48 h,用滤纸双重过滤后得到植株叶和根浸提液,浓度分别为0.40gmL、0.30 gmL 、0.20 gmL、0.10 gmL 、0.05 gmL,静置备用1.2.2 种子萌发及幼苗生长的测定挑选均匀饱满、大小一致的麻栎、厚皮香种子,用 3%的双氧水消毒 30 分钟,然后用蒸馏水冲洗干净。用规格 10*15 cm 营养袋装土培养,每组组设计五个浓度梯度,每个浓度设计 3 袋平行组,对照组 5 盆,每盆放置 6 粒麻栎种子。每天观察麻栎和厚皮香种子的萌发(胚根或胚轴破皮12mm 时为萌发)
18、情况,第 7 天完成统计,计算发芽率( GR) 。计算公式如下:GR=(发芽种子数/供试种子数)100%10 天后统计幼苗的苗高、苗鲜重、苗干重、根干重、根鲜重。 分别计算发芽率、苗高、苗鲜重、苗干重、根干重、根鲜重的化感效应指数(RI)和综合化感效应指数(SE) 。计算公式如下:当 T=C 时, RI=1-C/T当 T0 为促进作用,RI0 为抑制作用,绝对值的大小与强度一致。SE=总 RI 的平均值1.2.3 脯氨酸含量的测定 11取地上部(芽鞘和叶子) 0. 5 g, 用 3 % 磺基水杨酸 5mL 研磨提取, 匀浆移至离心管中, 在沸水浴中提取 10 min, 冷却后, 3000 r/
19、 min 离心 10 min,取上清液待测;制作标准曲线 100 g/ m L 脯氨酸配制成 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 g/mL 的标准溶液。取标准溶液各 2 mL, 加 2 mL 3 % 磺基水杨酸, 2mL 冰醋酸和 4 mL 2.5 % 酸性茚三酮试剂于具塞试管中, 置沸水浴中显色 1h ,冷却后加入 4 mL 甲苯盖好盖子于旋涡混合仪上振 0.5 min, 静置分层 , 吸取红色甲苯相, 于波长 520nm 测定 OD 值,以 OD 值为纵坐标, 脯氨酸浓度(g/ mL) 为横坐标绘制标准曲线。各取 2 mL 两种上清液, 分别加入 2 mL 蒸馏水, 2 mL 冰
20、醋酸和 4 mL 2.5% 酸性茚三酮试剂, 与上述制作标准曲线一样进行显色, 萃取和比色, 最后从标准曲线查得脯氨酸含量。计算公式为:脯氨酸含量(ug/g) )=X5/2/样重( g) 。1.2.4 MDA 含量测定 11楚雄师范学院本科论文(设计)3取植株上一定叶位的叶片,剪成小段,混匀,称取 0.3g 放入冰浴的砚钵中,加少许石英砂和2ml0.05mol/LPH 为 7.8 的磷酸缓冲液,研磨成匀浆。将匀浆转移到试管中,再用 2-3 ml0.05mol/L磷酸缓冲液分两次冲洗,合并提取液;在提取液中加入 5 ml 0.5%硫代巴比妥酸溶液,摇匀。将试管放入沸水中煮沸 10 分钟(自试管内
21、溶液中出现小气泡开始计时),到时间后立即将试管取出并放入冷水浴中;带试管内溶液冷却后,3000 g 离心 15min,取上清液并量其体积。以 0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白测 532nm、600nm、450nm 处的吸光度;结果计算:MDA(mmol.g-1FW)=6.452*(A652-A600)-0.559*A450*Vt/Vs*FW;式中,Vt:提取液总体积(ml),Vs:测定用提取液体积(ml),FW:样品鲜重(g)。1.2.5 POD 活性的测定 12称取植物材料 1 g, 加 20 m mol/ L KH2PO4 5 mL, 于研钵中研磨成匀浆, 以 4000 r/min 离心 1
22、5 min, 收集上清液保存在冷处, 所得残渣再用 5 mL KH2PO4 溶液提取一次, 合并两次上清液;取光径 1 cm 比色杯 2 只, 于 1 只中加入反应混合液 3 mL, KH2PO4 1mL, 作为校零对照, 另 1 只中加入反应混合液 3 mL, 上述酶液 1 mL(如酶活性过高可适当稀释) ,立即开启秒表计时,于分光光度计470 nm 波长下测量 OD 值, 每隔 1min 读数一次。以每分钟 OD 变化值表示酶活性大小, 即以OD470/min/mg 蛋白质(或鲜重 g) 表示。蛋白质含量测定按 Folin 法进行或用考马斯亮蓝法测定。1.2.6 细胞形态的观察制作不同浓度
23、处理的三叶鬼针草和麻栎植株根和茎尖显微切片,探索其细胞形态的变化。1.2.7 数据处理采用 Excel、SPSS Statistics 18.0 进行分析与整理。2 结果与分析2.1 厚皮香叶浸提液对三叶鬼针草和麻栎种子萌发率的影响从表 1 可以看出,厚皮香叶浸提液对三叶鬼针草种子萌发的影响表现为抑制,随着厚皮香叶浸提液浓度的升高,种子的萌发率降低。把麻栎种子的萌发率进行单因素方差分析,P0.000,说明厚皮香叶的浸提液对麻栎种子萌发的影响达到极显著水平。0.15g/ml 的厚皮香叶浸提液与对照组差异显著(P=0.45) ,其它浓度下,差异达到极显著水平(附录 1) ,说明厚皮香叶浸提液对三叶
24、鬼针草种子萌发具有显著的抑制作用。随着厚皮香叶浸提液浓度的升高,三叶鬼针草种子萌发率受到影响,对麻栎种子萌发的抑制作用增强。把萌发率的化感指数进行单因素方差分析,P0.000,说明各浓度间的化感效应指数差异楚雄师范学院本科论文(设计)4达到极显著水平。综上所述,厚皮香叶浸液对三叶鬼针草和麻栎种子萌发率作用明显,可能作为化感作用的一项生理指标。表 1 厚皮香叶浸提液对三叶鬼针草和麻栎种子萌发及幼苗生长的影响Table .1 thick skin Geranium effects of extracts on Germination and seedling growth of Bidens pi
25、losa and seeds of Quercus acutissima水浸液浓度(g/ml) 受体植物萌发率(%)株高(cm)根长(cm)三叶鬼针草 92.0 19.7000 8.9324ck麻栎 89.6 18.0330 15.9000三叶鬼针草 73.0 14.5300* 8.26380.05麻栎 78.0* 16.2000 13.4333三叶鬼针草 73.0 15.5330 6.8000*0.10麻栎 75.7* 7.7000* 11.9607*三叶鬼针草 55.0* 17.800 3.9542*0.15麻栎 44.0* 5.7333* 5.687*三叶鬼针草 26.0* 9.4330
26、* 4.7667*0.20麻栎 73.3* 7.667* 6.764*三叶鬼针草 30.0* 9.7000* 4.7000*0.25麻栎 74.0* 9.3667* 6.4000注:* 表示实验组与对照组的差异显著性。* 表示差异显著。* 表示差异极显著。P=0.05。下表同。2.2 厚皮香叶浸提液对三叶鬼针草麻栎幼苗的株高影响附录 1 可以看出,厚皮香叶浸提液对麻栎幼苗的苗高的影响表现为抑制,随着厚皮香叶浸提液浓度的升高,幼苗的株高降低。把麻栎幼苗的株高进行单因素方差分析,P0.000,说明各浓度间的株高差异极显著。0.05g/ml 处理的实验组的幼苗株高与对照组的幼苗株高差异不显著(P=0
27、.85) ;其它浓度下的幼苗的株高与对照组的差异极显著(P0.000 ) 。说明低浓度下的厚皮香叶浸提液对麻栎幼苗的株高没有明显影响,高浓度下的厚皮香叶浸提液对麻栎幼苗的株高影响显著。随着厚皮香叶浸提液浓度的升高,麻栎幼苗株高的化感指数增大,对麻栎幼苗株高的抑制作用增强。把株高的化感指数进行单因素方差分析,P0.000,说明各浓度间的化感效应指数差异达到极显著水平。0.05 g/ml(P=0.200 ) 、0.10 g/ml(P=0.079)、0.15 g/ml(P=0.057)浓度下的实验组的幼苗株高与对照组差异不显著,0.20 g/ml(P=0.010) 、0.25 g/ml(P=0.027)的株高化感效应与对照组的差异显著,说明低浓度的厚皮香叶浸提液对麻栎幼苗株高的化感指数影响不显著,高浓度下影响显著。这表明幼苗株高可能不是衡量化感作用的敏感指标。